基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探討清熱卡森顆粒治療腎性水腫的分子機(jī)制

段艷芬 張東寧 侯帥紅 莫國艷 韓林濤 黃 芳 尹 強(qiáng), 李晶晶

1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北武漢 430065；2.新疆維吾爾藥業(yè)有限責(zé)任公司，新疆烏魯木齊 830026；3.湖北中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北武漢 430065

清熱卡森顆粒是由菊苣加工制成的單味制劑，其具有利尿、消水腫的作用，用于治療濕熱黃疸、胃痛食少、水腫少尿等癥狀，菊苣同時具有潤腸通便、健胃、利尿和促進(jìn)傷口愈合效果[1-3]。腎性水腫常由腎病綜合征、急性和慢性腎炎、急性和慢性腎功能不全等腎疾病引起，首先發(fā)生在機(jī)體松散組織，進(jìn)而發(fā)展至腳踝和下肢，直至全身，甚至腹水[4]。該病易復(fù)發(fā)，可導(dǎo)致蛋白尿、血尿、高血壓病等系統(tǒng)損傷[5]，一般使用西藥利尿劑治療，但一些特發(fā)性水腫患者長期服用利尿劑呋塞米反而會增加水腫，即出現(xiàn)藥物誘導(dǎo)性水腫[6]。因此探索新的利尿藥物尤為重要，菊苣利水消腫的作用在維吾爾族醫(yī)學(xué)中應(yīng)用廣泛，但其治療腎性水腫的作用機(jī)制和靶點(diǎn)尚不清楚。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對接技術(shù)探討清熱卡森顆粒治療腎性水腫可能的作用機(jī)制，為腎性水腫的治療研究提供新思路。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)打破以往單組分、單靶點(diǎn)的概念[7]。分子對接常用于藥理研究中探索新的疾病治療靶點(diǎn)。本研究采用SwissADME中的參數(shù)對清熱卡森顆粒的化學(xué)成分進(jìn)行篩選，利用分子對接技術(shù)揭示清熱卡森顆粒的有效成分與腎性水腫的治療靶基因復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，解釋清熱卡森顆粒的多組分、多靶點(diǎn)、多路徑的作用機(jī)制[8-10]。

1 資料與方法

1.1 清熱卡森顆?；钚猿煞趾Y選

從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）[11]和相關(guān)文獻(xiàn)[12-13]中查找清熱卡森顆粒化學(xué)成分，采用PubChem數(shù)據(jù)庫搜索成分，保存SMILES結(jié)構(gòu)。導(dǎo)入SwissADME中得到藥物的相關(guān)參數(shù)，其中GI absorption代表胃腸道吸收和大腦進(jìn)入，是兩種藥代動力學(xué)行為，在藥物發(fā)現(xiàn)過程的不同階段其對藥物評估至關(guān)重要[14]。Lipinski規(guī)則可以比較準(zhǔn)確地預(yù)測化合物的吸收或滲透性能，其中有關(guān)親脂性的規(guī)則可以評估類藥性[15-16]。本研究以GI absorption=High、Lipinski規(guī)則違反次數(shù)≤0為條件參數(shù)篩選得到其有效成分。

1.2 清熱卡森顆粒化合物靶點(diǎn)篩選

根據(jù)Swiss數(shù)據(jù)庫，選取結(jié)果中probability ＞0的靶標(biāo)進(jìn)行分析。

1.3 清熱卡森顆粒治療腎性水腫靶點(diǎn)篩選及其網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在疾病數(shù)據(jù)庫GeneCards、Malacards、OMIM中，通過關(guān)鍵詞“Renal edema”合并去重后獲得疾病靶點(diǎn)。

1.4 基因功能與途徑分析

運(yùn)用R語言進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析清熱卡森顆粒治療腎性水腫的作用機(jī)制。以P ＜0.05，F(xiàn)DR＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 活性成分-靶點(diǎn)基因-富集通路網(wǎng)絡(luò)圖

將活性成分、靶點(diǎn)基因和富集通路導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0軟件，構(gòu)建三者的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 分子對接驗(yàn)證

利用Cytoscape 3.7.0中CentiScape插件計(jì)算度值（Degree），選取Degree排名前10位的靶點(diǎn)與化合物，分別利用AutoDockTools 1.5.6進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。采用PyMOL軟件對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和活性成分進(jìn)行修飾，在相同條件下進(jìn)行分子對接實(shí)驗(yàn)，獲得可能與靶蛋白結(jié)合并發(fā)揮藥理作用的有效成分。一般認(rèn)為，分子對接結(jié)合能的絕對值＞4.25說明具有一定的結(jié)合活性，對接結(jié)合能絕對值＞5.0說明結(jié)合活性較好，對接結(jié)合能絕對值＞7.0說明具有很強(qiáng)烈的結(jié)合活性[17-18]。

2 結(jié)果

2.1 清熱卡森顆?；钚猿煞趾Y選

結(jié)合數(shù)據(jù)庫與文獻(xiàn)檢索初步篩選出35個活性成分。SwissADME篩選結(jié)果表明這35種化合物在體內(nèi)效果較好，主要為黃酮類、萜類、苯丙素類等。35種化合物過濾條件的SwissADME參數(shù)見表1。

表1 清熱卡森顆?；钚猿煞只拘畔?/p>

2.2 潛在目標(biāo)篩選

在疾病數(shù)據(jù)庫中合并去重后獲得1397個與疾病有關(guān)的基因，其中有153個治療腎性水腫的潛在靶基因。

2.3 基因功能與途徑分析

利用R語言3.6.1和Bioconductor等數(shù)據(jù)包提取信息，設(shè)定閾值P ＜0.05，F(xiàn)DR＜0.05，GO富集分析結(jié)果見圖1（封三）。KEGG途徑注釋顯示，153個潛在靶基因中有150個（98.0%）富集，涉及155條途徑，基因顯著富集在PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、Ras信號通路等。見圖2（封三）。

圖1 清熱卡森顆粒治療腎性水腫的GO富集

圖2 清熱卡森顆粒治療腎性水腫的KEGG通路富集

2.4 化合物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

將篩選得到的35個活性成分、153個靶點(diǎn)基因和KEGG通路分析的前12條相關(guān)途徑導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0軟件中構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)基因-富集通路網(wǎng)絡(luò)圖，圖中共有200個節(jié)點(diǎn)（活性成分35個，靶點(diǎn)153個，通路12個）。圖中最外圈圓形代表通路，最內(nèi)圈的圓形代表活性成分，其他代表靶點(diǎn)。見圖3。

圖3 活性成分-靶基因-富集途徑網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 分子對接驗(yàn)證

根據(jù)Degree排名前10的靶點(diǎn)有EGFR、KDR、MAPK3、IGF1R、AKT1、GSK3B、MAPK1、PRKCA、SRC、MMP9。排名前8的化合物有毒扁豆胺堿、木蘭素A、山萵苣素、秦皮乙素、11β，13-二氫山萵苣素、良姜素、槲皮素、11β，13-二氫山萵苣苦素。靶點(diǎn)與化合物的分子對接結(jié)合能打分的絕對值結(jié)果顯示，篩選得到的活性成分與靶點(diǎn)的對接結(jié)合能均具有較好的活性。見圖4（封四）。

圖4 核心靶點(diǎn)與化合物的分子對接結(jié)合能打分熱圖

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)菊苣即清熱卡森顆粒中萜類化合物活性最強(qiáng)，其次是黃酮類化合物，其活性成分山萵苣素、秦皮乙素、槲皮素等富集程度較高。根據(jù)Degree值可知EGFR、KDR、MAPK3、IGF1R、AKT1、GSK3B等為清熱卡森顆粒治療腎性水腫的重要靶點(diǎn)。有研究表明菊苣包含苦味物質(zhì)秦皮乙素，具有鎮(zhèn)痛、利尿、促進(jìn)尿酸排泄的作用[19]。山萵苣苦素在菊苣中含量較高，特異性強(qiáng)，其保肝作用主要與倍半萜內(nèi)酯成分有關(guān)，且具有抗瘧疾的作用[20]。Weso?owska等[21]研究報(bào)道，前列腺素E2（PEG2）能增強(qiáng)疼痛反應(yīng)和水腫，而8-去氧山萵苣素、山萵苣素、山萵苣苦素等化合物可使PEG2減少，減輕水腫。黃酮類化合物槲皮素、木犀草素屬于黃嘌呤氧化酶抑制劑的非嘌呤類似物[22]。有文獻(xiàn)研究[23]提示，槲皮素可能是潛在的預(yù)防炎癥性腎損傷的治療物質(zhì)，此外，槲皮素能抑制M2巨噬細(xì)胞的極化，從而減少腎纖維化。通過KEEG富集分析發(fā)現(xiàn)，清熱卡森顆粒治療腎性水腫的作用主要與PI3K-Akt、MAPK、Ras、Rap1等信號通路密切相關(guān)。其中PI3K-Akt靶基因數(shù)目最多，PI3K-Akt信號通路在腎纖維化的過程中起重要作用，還參與降低腎細(xì)胞外基質(zhì)的堆積，以及抑制腎惡性腫瘤患者病情的惡化[24-25]。MAPK等信號通路，如細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶途徑等是參與腎纖維化的重要信號通路[26]。Ras及Rap1信號通路能夠介導(dǎo)腎小球炎癥損傷[27-28]。Rap1信號通路與腎纖維化靶標(biāo)相關(guān)的數(shù)量較多，具有多種合作途徑，能夠調(diào)節(jié)腎纖維化的進(jìn)程，參與細(xì)胞凋亡和炎癥等[29]。本研究在分子對接過程中，選取排名靠前的8個有效成分化合物與核心靶蛋白進(jìn)行對接，結(jié)合能均為負(fù)值，提示模型對接效果好，進(jìn)而證明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果可靠、準(zhǔn)確。清熱卡森顆粒可能通過EGFR、KDR、MAPK3、IGF1R、AKT1、GSK3B等靶點(diǎn)來干預(yù)腎性水腫及其并發(fā)的炎癥反應(yīng)，預(yù)防炎癥性腎損傷，減少腎纖維化，維系腎臟濾過屏障。本研究仍具有一定的局限性，如探究清熱卡森顆粒治療腎性水腫的詳細(xì)作用后期需進(jìn)一步對菊苣潛在活性成分、作用靶點(diǎn)及通路進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)和PCR技術(shù)等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接，提示清熱卡森顆?？赏ㄟ^多成分、多靶點(diǎn)、多通路的形式來治療腎性水腫，為臨床研究提供依據(jù)。