多指標綜合評分法優(yōu)選黃芪三七合劑提取工藝

蘭 楊 張仕瑾 王婭俐 郭廷東 唐志立 謝席勝

1.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院 四川省南充市中心醫(yī)院藥學(xué)部個體化藥物治療南充市重點實驗室，四川南充 637000；2.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院 四川省南充市中心醫(yī)院腎內(nèi)科，四川南充 637000

黃芪三七合劑處方是四川省南充市中心醫(yī)院腎內(nèi)科謝席勝主任醫(yī)生根據(jù)益氣養(yǎng)血、活血利水、健脾助運治法結(jié)合多年臨床經(jīng)驗總結(jié)得到的臨床驗方，該方由黃芪、三七、當歸、牛膝、昆布、薏苡仁、山藥、甘草等八味中藥組成，臨床用于治療3～4期慢性腎臟病，對改善慢性腎臟病患者臨床癥狀以及延緩病情向終末期發(fā)展具有顯著療效[1-2]。已有文獻報道[3-5]，黃芪中活性成分毛蕊異黃酮葡萄苷具有抗炎、抗病毒、免疫抑制的作用；當歸中阿魏酸抗氧化能力較強，能有效地清除多種自由基，同時還具有抗血栓、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性；三七中人參皂苷Rg1具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、保護腎臟的作用。本方以湯劑的形式在臨床上使用，由于慢性腎臟病患者需長期服藥，湯劑煎煮麻煩，儲藏和攜帶不便。因此，為提高患者順應(yīng)性，同時保證臨床療效，在不改變原湯劑物質(zhì)基礎(chǔ)的前提下，將其開發(fā)成服用方便、療效穩(wěn)定的合劑。本實驗以人參皂苷Rg1、毛蕊異黃酮葡萄苷、阿魏酸三者的含量及浸膏得率的綜合評分為評價指標，采用正交試驗優(yōu)選提取工藝參數(shù)，為該制劑后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

LC-16高效液相色譜儀（日本島津公司）；TGL-18M臺式高速冷凍離心機（鹽城市凱特實驗儀器有限公司）；BP211D電子分析天平（精密度十萬分之一，北京賽多利斯）。

1.2 試藥與試劑

阿魏酸對照品（批號：110773-201915）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（批號：111920-201907）、人參皂苷Rg1對照品（批號：110703-202034）均購自中國食品藥品檢定研究院；實驗所用飲片均購自四川省中藥飲片有限公司，由四川省南充市中心醫(yī)院藥學(xué)部郭廷東主任中藥師鑒定，均符合2015版《中華人民共和國藥典》[6]相關(guān)項下要求。乙腈為色譜純，水為蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸及人參皂苷Rg1含量測定方法

2.1.1 色譜條件參考相關(guān)文獻[7-9]，色譜柱為SHIMADZUGL inertsil C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.1%磷酸水（B）作為流動相，梯度洗脫：0～18 min，19% A；18～25 min，19%～24% A；25～55 min，24% A；55～60 min，24%～19%A；檢測波長：毛蕊異黃酮葡萄糖苷（260 nm），阿魏酸（320 nm），人參皂苷Rg1（203 nm）；柱溫：35℃；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱定毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品、阿魏酸對照品、人參皂苷Rg1對照品適量，置100 mL容量瓶中，加甲醇制成每1 mL含毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、人參皂苷Rg1分別為46.3、112.3、92.6 μg的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密吸取正交試驗項下提取液10 mL至25 mL容量瓶中，用75%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.2”項下混合對照品溶液1、2、4、6、8、10 μL，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析。以進樣量為橫坐標（X），峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得線性范圍和回歸方程。見表1。結(jié)果顯示各成分在進樣范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

圖1 混合對照品、供試品高效液相色譜圖

表1 線性范圍和回歸方程

2.2 評價指標

以處方中有效成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、人參皂苷Rg1的含量以及浸膏得率的綜合評分為指標，根據(jù)方劑君臣佐使的配伍理念以及各指標在處方中的相對重要性分配權(quán)重系數(shù)，各指標權(quán)重系數(shù)依次設(shè)為0.5、0.2、0.2、0.1[10-13]。綜合評分＝毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量/毛蕊異黃酮葡萄糖苷最大含量×0.5×100+阿魏酸含量/阿魏酸最大含量×0.2×100+人參皂苷Rg1/人參皂苷Rg1最大含量×0.2×100+浸膏得率/最大浸膏得率×0.1×100。

2.3 浸膏得率的測定

取正交試驗項下提取液50 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中（A1），水浴蒸干，105℃干燥3 h，置干燥器中冷卻至室溫，立即稱定質(zhì)量（A2），，A為處方藥材質(zhì)量，U為提取液體積[14-17]。

2.4 正交試驗優(yōu)選提取工藝參數(shù)

在前期單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇加水倍數(shù)、提取時間、提取次數(shù)作為正交試驗考察因素，因素水平見表2，試驗結(jié)果見表3，方差分析見表4。試驗結(jié)果采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，由表4方差分析結(jié)果顯示C因素具有顯著性（P ＜0.05），A、B因素均無顯著性，為了降低生產(chǎn)成本和提高生產(chǎn)效率，確定最佳提取工藝條件為A2B1C3，即加10倍量水，提取4次，每次30 min[18-20]。

表2 正交試驗因素水平

表3 正交試驗設(shè)計及結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

2.5 驗證試驗

按上述優(yōu)選的提取工藝重復(fù)3次，依法測定毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、人參皂苷Rg1含量及浸膏得率。結(jié)果，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、人參皂苷Rg1平均含量分別為0.61、1.51、26.23 mg/g，RSD分別為0.94%、1.38%、1.20%，浸膏得率均值為41.02%，RSD為0.71%，綜合評分均值為97.74，RSD為0.09%，結(jié)果顯示優(yōu)選的工藝參數(shù)穩(wěn)定、重復(fù)性較好，可作為黃芪三七合劑的提取工藝。

3 討論

中藥復(fù)方常以多組分、多靶點共同發(fā)揮療效，以單一組分或成分為指標來篩選工藝難以反應(yīng)復(fù)方的整體功效[21-23]。目前，多指標綜合評分法已廣泛應(yīng)用于中藥復(fù)方制劑的提取、成型工藝篩選，通過對多個指標成分賦予客觀權(quán)重系數(shù)，計算綜合評分，較單一成分評價指標更能全面客觀的評價工藝優(yōu)劣[24-27]。毛蕊異黃酮葡萄糖苷為君藥黃芪中有效成分，阿魏酸、人參皂苷Rg1分別為臣藥當歸、三七中有效成分，浸膏得率影響后續(xù)成型工藝。根據(jù)方劑君臣佐使的配伍理念以及各指標在處方中的相對重要性，故將四者權(quán)重系數(shù)依次設(shè)為0.5、0.2、0.2、0.1。驗證結(jié)果顯示，工藝合理可行。本研究建立了多波長同時測定毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、人參皂苷Rg1三者含量的方法，試驗過程中對比了等度洗脫和梯度洗脫兩種方式，對照品色譜中兩種洗脫方式各目標峰分離度均較好，等度洗脫時供試品色譜中目標峰與雜質(zhì)分離度小于1.5，不符合分析要求，故選擇梯度洗脫。同時，考察了甲醇-磷酸水系統(tǒng)、乙腈-磷酸水系統(tǒng)，結(jié)果乙腈-磷酸水系統(tǒng)峰型更好，經(jīng)反復(fù)調(diào)整流動相比例及多次試驗，最終確定了文中色譜條件，方法學(xué)驗證結(jié)果顯示所建方法準確度高、重復(fù)性好，可用于三者含量同時測定。