基于蛋白質(zhì)組學(xué)方法對急性期中風(fēng)的物質(zhì)基礎(chǔ)及相關(guān)機制的研究

劉 濤 唐 濤

1.新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院博士后科研工作站，新疆烏魯木齊 830000；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，湖南長沙 830054

中風(fēng)已成為導(dǎo)致人類死亡的第三大致死性疾病[1]。傳統(tǒng)中醫(yī)對“中風(fēng)”的認(rèn)識可追溯到《黃帝內(nèi)經(jīng)》，明確定義“中風(fēng)”見于《金匱要略》，初步分類見于《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》。隨著CT等技術(shù)的引入，現(xiàn)代中醫(yī)臨床已將中風(fēng)分為缺血性中風(fēng)（IS）與出血性中風(fēng)（ICH）。然而，中醫(yī)藥在急性期中風(fēng)時采用相同的治法取得較好的療效[2-3]，而其共性物質(zhì)基礎(chǔ)研究未見報道。因此，運用基于相對和絕對定量同位素標(biāo)記（iTRAQ）的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法，研究IS和ICH模型大鼠整體蛋白質(zhì)圖譜，揭示急性期中風(fēng)的共性物質(zhì)基礎(chǔ)及分子機制，為急性期中風(fēng)治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠40只，6～7周齡，180～200 g，購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司[許可證號：SCXK（湘）2013-0004]。所有動物寄養(yǎng)中南大學(xué)實驗動物學(xué)部提供，采用“3只/籠”在標(biāo)準(zhǔn)實驗室條件（50±10）%相對濕度，晝夜12 h循環(huán)，溫度控制在22～25℃下進行分籠飼養(yǎng)，并自由進食、水。所有實驗均得到中南大學(xué)動物倫理委員會的批準(zhǔn)（201403164）。

1.2 主要試劑與儀器

Ⅶ型膠原酶（Sigma，批號C0773），8-plex iTRAQ試劑盒（AB Sciex，貨號：4381664）；立體定位儀（美國，Stoelting Co.，Chicago，IL）；高效液相色譜（日本，島津，LC-20AD）；液相色譜（美國，Thermo Scientific，Ultimate 3000）；質(zhì)譜儀（美國，Thermo Scientific，Q Exactive）。

1.3 方法

1.3.1 分組 40只SD大鼠采用隨機數(shù)字表法進行分組：IS假手術(shù)（Sham1）組、IS模型（IS）組、ICH假手術(shù)（Sham2）組和ICH模型（ICH）組，每組10只。IS組和Sham1組自由飲食后，24 h后生理鹽水灌注后取腦；ICH組和Sham2組在48 h后，生理鹽水灌注后取腦。每組4只大鼠進行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，剩余每組6只進行蛋白驗證。

1.3.2 實驗動物ICH及IS造模 ICH模型采用膠原酶來誘導(dǎo)的腦出血模型、IS大鼠模型采用線栓法制備缺血再灌注模型。整個造模過程參照前期研究標(biāo)準(zhǔn)[4-5]。

1.3.3 留取標(biāo)本 大鼠稱重后，按50 mg/kg腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉；麻醉后沿著劍突下行橫向切口，鈍性分離并暴露膈肌，剪開膈肌，勿損傷心臟，剪斷左側(cè)肋骨，暴露心臟。于心尖左緣向升主動脈方向進針，置入升主動脈，固定針頭，鉗夾腹主動脈。剪開右心耳，快速滴入生理鹽水，直至右心耳流出清澈生理鹽水后，開顱取腦。最后，將患側(cè)一半腦組織迅速放入液氮速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 腦組織樣本處理 往腦組織中加入400 μL裂解液RIPA，反復(fù)吹打裂解細(xì)胞。裂解后予以超聲處理（2%，1 s開，1 s關(guān)，超聲5次后放于冰上冷卻，上述過程重復(fù)8次），4℃，12 000 r/min，離心半徑13.5 cm，離心20 min，收集上清液。進行BCA法蛋白質(zhì)定量后，按照前期研究參數(shù)[5]，收集管底部共得到100 μL酶解后的樣品。

1.3.5 iTRAQ試劑標(biāo)記的定量分析 取出8標(biāo)iTRAQ試劑盒，平衡至室溫，將iTRAQ試劑離心至離心管管底；向每管iTRAQ中加入150 μL異丙醇，振蕩，離心至離心管管底；取50 μL樣品（100 μg酶解產(chǎn)物）轉(zhuǎn)移到新的離心管中；將iTRAQ試劑添加到樣品中，振蕩，4℃，12 000 r/min，離心半徑13.5 cm，離心至離心管管底，室溫反應(yīng)2 h；加入100 μL超凈水終止反應(yīng)；混合標(biāo)記后的樣品，振蕩，離心至離心管管底；真空冷凍離心干燥后，冷凍保存待用。

1.3.6 第一維高效液相分離 第一維高效液相分析采用75 μm ID×150 mm，2 μm，100 ? 色譜柱。A相：20 mmol/L HCOONH4，pH 10；B相：20 mmol/L HCOONH4，80%ACN，pH 10；紫外檢測波長：214 nm/280 nm，流速：200 μL/min。從線性梯度開始收集組分，收集到24個EP管中，每分鐘收集1管，輪流收集，梯度為90 min；根據(jù)峰型和時間共收取24個組分，用50%TFA酸化，真空干燥后，進行第二維反相液質(zhì)聯(lián)用分析。

1.3.7 第二維反相液質(zhì)聯(lián)用分析 酶解產(chǎn)物經(jīng)nano-RSLC液相色譜分離后聯(lián)用Q-Exactive質(zhì)譜儀（Thermo Scientific）在線進行質(zhì)譜分析。分析時長：65 min/樣本，正離子檢測模式，母離子掃描范圍：unique pep tides m/z。一級質(zhì)譜參數(shù)：分辨率：70 000，AGC靶：3E+6，最大離子注入時間（Max IT）：40 ms，掃描范圍：350～1800 m/z；二級質(zhì)譜參數(shù)：分辨率：17 500，AGC靶：1E+5，Max IT：60 ms。標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能量（NCE）：28%，隔離窗口：2 m/z，動態(tài)排除時間：60 s。

1.3.8 蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)分析 差異表達(dá)蛋白（DEPs）篩選標(biāo)準(zhǔn)：最優(yōu)蛋白得分（Unused）≥1.3；差異倍數(shù)＞1.3（上調(diào)）或＜0.77（下調(diào)）；偽發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜1%。采用基因功能（GO）和STRING10.5分析。

1.3.9 蛋白免疫印跡（Western blot）根據(jù)課題組前期實驗方法[5]進行Western blot分析。具體如下：一抗孵育：神經(jīng)絲蛋白輕鏈多肽（Nefl，1∶1000）；酪氨酸羥化酶（Th，1∶3000）；神經(jīng)調(diào)制蛋白（Gap43，1∶1500）；Atp6v1f（1∶1000）；Atp6v1a（1∶2000）；β-actin（1∶5000）。二抗[兔抗（R）1∶6000，鼠抗（M）1∶5000]。之后用ECL kit來檢測抗原-抗體-過氧化物酶混合物的量，同時通過曝光到柯達(dá)膠卷可視化不同蛋白條帶。最后，用Image Lab圖像分析軟件定量條帶的灰度值，以確定Nefl、Th、Gap43、Atp6v1f和Atp6v1a的相對表達(dá)量。蛋白質(zhì)的表達(dá)量以相對值與β-actin的比值表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)處理，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，方差齊時，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；方差不齊時，多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，進一步兩兩比較采用Nemenyi法。以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 急性期IS及ICH模型大鼠DEPs的變化

本研究共檢測急性期IS疾病相關(guān)DEPs有345個，其中上調(diào)96個，下調(diào)249個；急性期ICH疾病相關(guān)DEPs有425個，其中上調(diào)248個，下調(diào)177個；急性期IS和ICH共性DEPs有57個，其中上調(diào)20個，下調(diào)37個。見表1。

2.2 DEPs的生物信息學(xué)分析

2.2.1 GO分析 在細(xì)胞組成分類中，外泌體、細(xì)胞漿、質(zhì)膜和線粒體所占比例較高，而在富集分析中排序前三的是外泌體、髓鞘和神經(jīng)突觸（圖1A、1B）；在分子功能分類中，蛋白結(jié)合、相同蛋白結(jié)合、域蛋白的特異性結(jié)合和磷脂酰絲氨酸結(jié)合所占比例較高，而在富集分析中蛋白結(jié)合、磷脂酰絲氨酸結(jié)合和髓鞘結(jié)構(gòu)成分排序前三（圖1C、1D）；在生物過程分類中，對藥物反應(yīng)、對缺氧反應(yīng)和脂多糖應(yīng)答所占比例較高，而在富集分析中神經(jīng)絲束組裝、丙烯酰胺的反應(yīng)和中間纖維束的裝配分別排序前三（圖1E、1F）。

2.2.2 KEGG分析 本研究篩出17條信號通路，其中富集較多蛋白的有3條：代謝通路、肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）通路和吞噬通路。根據(jù)ALS通路、集合管泌酸通路、丙酸代謝通路、酪氨酸代謝通路和丙酮酸代謝通路富集顯著。見表2。綜合分析后，ALS通路、丙酸代謝通路、酪氨酸代謝通路和丙酮酸代謝通路為急性期中風(fēng)“異病同證”的主要信號通路。

2.2.3 DEPs驗證 IS組和Sham1組的Nefl、Gap43、Atp6v1f、Th和Atp6v1a表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。ICH組和Sham2組的Nefl、Gap43、Atp6v1f、Th和Atp6v1a表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。其中，Nefl表達(dá)為上調(diào)，Gap43、Atp6v1f、Th和Atp6v1a表達(dá)為下調(diào)，此結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)檢測結(jié)果一致。見圖2。

3 討論

3.1 急性期中風(fēng)的主要物質(zhì)基礎(chǔ)

Nefl屬于神經(jīng)絲蛋白的主要亞型之一，是神經(jīng)元主要的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)蛋白，大量分布于軸突中[6-7]。Nefl亦是判斷急性軸突損傷的重要指標(biāo)[6]。在復(fù)發(fā)性多發(fā)性硬化癥的臨床研究中，Nefl作為藥物抗炎治療有效評價指標(biāo)[8]。在本研究中，IS及ICH模型大鼠的Nefl表達(dá)水平較高，說明急性期中風(fēng)存在急性的軸突損傷，可能與存在急性炎癥有關(guān)。同時，Nefl水平亦可作為急性期中風(fēng)的神經(jīng)損傷判定指標(biāo)之一。

Gap43又稱為神經(jīng)生長相關(guān)蛋白43或B-50，首次被發(fā)現(xiàn)來源于大鼠腦組織的突觸體質(zhì)膜的分離[9]。Gap43參與神經(jīng)元的形成和再生的調(diào)控，Gap43的表達(dá)與突觸結(jié)構(gòu)可塑性之間關(guān)系密切[10]。Gap43磷酸化影響行為記憶，主要因為長時程蛋白誘導(dǎo)與增加Gap43的磷酸化密切相關(guān)[11]。在實驗結(jié)果中，IS組及ICH組的Gap43表達(dá)水平較低，提示急性期中風(fēng)神經(jīng)元及軸突損傷明顯，但再生及重塑水平低下。因此，在急性期中風(fēng)的治療中Gap43可作為重要的潛在靶點。

表1 急性期中風(fēng)共性DEPs表達(dá)情況

圖1 57個共性DEPs的Quick GO分析

表2 57個共性DEPs所富集的所有信號通路

Th是一種蝶啶依賴性的單加氧酶。Th能在神經(jīng)元細(xì)胞中表達(dá)，參與兒茶酚胺代謝[12]。研究表明，Th在腦組織藍(lán)斑中的表達(dá)被確定為與抗應(yīng)激的作用機制相關(guān)[13]。在蛛網(wǎng)膜下腔出血時，Th在黑質(zhì)和紋狀體中的表達(dá)均降低，提示多巴胺的產(chǎn)生減少[14]。本研究中，IS組及ICH組的Th表達(dá)水平較低，可以推測急性期中風(fēng)時腦組織中多巴胺產(chǎn)生減少，最終通過多巴胺能突觸產(chǎn)生對大鼠神經(jīng)功能的影響。因此，多巴胺樣效應(yīng)低下的行為學(xué)可以作為急性期中風(fēng)神經(jīng)功能損傷判斷的一種參考。

圖2 DEPs的Western blot驗證情況（n=6）

V-ATP酶是膜相關(guān)的多亞基蛋白復(fù)合物，功能是ATP驅(qū)動的質(zhì)子泵，包括Atp6v1a和Atp6v1f亞型[15]。V-ATP酶利用ATP水解生成ADP的能量將質(zhì)子泵過膜和調(diào)節(jié)囊泡室、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外間隙的pH值[16]。Atp6v1a是V-ATP的催化亞基，它能使溶酶體酸化，并與雷帕霉素蛋白的機制靶標(biāo)發(fā)生相互作用，在調(diào)節(jié)自噬中起著重要的作用[17]。Atp6v1f是V-ATP酶的一種類型，作用亦是介導(dǎo)酸化[18]。本研究中Atp6v1a和Atp6v1f在IS組及ICH組均顯示下調(diào)，提示急性期中風(fēng)涉及V-ATP酶功能是受損的情況。

3.2 急性期中風(fēng)的主要信號通路

ALS通路是由54個基因構(gòu)成。在ALS通路圖上，共有35個蛋白質(zhì)實體，包括膜受體、胞漿蛋白或分泌蛋白、激酶、磷酸酶、蛋白酶和蛋白通道，它們在ALS發(fā)病的不同階段有不同程度的直接/間接作用，導(dǎo)致運動神經(jīng)元的失活[19]。在本研究中谷氨酸受體1（Gria1）、Nefl、神經(jīng)絲蛋白中鏈多肽（Nefm）和神經(jīng)絲蛋白重鏈多肽（Nefh）等4個蛋白質(zhì)富集在ALS通路中。Gria1也稱作5α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體（AMPAR1），主要在小背根神經(jīng)節(jié)中神經(jīng)元表達(dá)，在初級感覺傳入系統(tǒng)中起重要作用[20]。神經(jīng)絲由Nefl、Nefm和Nefm三種不同大小的鏈組成，是軸突細(xì)胞骨架蛋白的主要組成部分[21]。因此，急性期中風(fēng)的主要機制可能是通過調(diào)節(jié)ALS通路中Gria1、Nefl、Nefm和Nefh而產(chǎn)生。

丙酮酸代謝和丙酸代謝屬于碳水化合物代謝，酪氨酸代謝為氨基酸代謝，因此均歸能量代謝范疇。本研究中乙醛酸/羥基丙酮酸還原酶（Grhpr）和L-乳酸脫氫酶（Ldha）富集在丙酮酸代謝，L-乳酸脫氫酶（Ldha）和烯酰輔酶A水合酶（Echs1）富集在丙酸代謝，Th和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Got2）富集在酪氨酸代謝。Grhpr是生物體內(nèi)能量和物質(zhì)代謝過程中的一種酶，能在NAD（P）+的條件下催化D-甘油酸為羥基丙酮酸。Ldha位于細(xì)胞的線粒體，在糖異生中發(fā)揮重要作用[22]。Echs1參與線粒體中纈氨酸到丙?；o酶A的降解過程[23]。Th在神經(jīng)元細(xì)胞中表達(dá)，催化L-酪氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)長-DOPA，參與兒茶酚胺代謝[12，24]。Got2參與檸檬酸循環(huán)代謝過程，在腦能量代謝中發(fā)揮一定的作用[25]。因此，Grhpr、Ldha、Echs1、Th和Got2在能量代謝中起重要作用，構(gòu)成了急性期中風(fēng)的能量代謝通路。