循環(huán)血腫瘤細(xì)胞檢測在根治性膀胱全切術(shù)后評估中的臨床研究

康 曦 李 琴 劉 方

江西省萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院泌尿外科，江西萍鄉(xiāng) 337000

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，病死率和發(fā)病率居于我國泌尿系統(tǒng)腫瘤的首位，多呈浸潤性發(fā)展，惡性程度較高[1]。根治性膀胱全切術(shù)是治療膀胱癌的有效手段，但5年生存率僅為26%～64%，大部分患者死于腫瘤轉(zhuǎn)移，目前尚無有效的方法預(yù)測膀胱腫瘤的復(fù)發(fā)、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移以及評估術(shù)后治療效果[2-3]。血行傳播是惡性腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要途徑，循環(huán)血腫瘤細(xì)胞（CTC）是指從原發(fā)病灶脫落進(jìn)入血液循環(huán)的細(xì)胞，在一定條件可在遠(yuǎn)處器官定植，形成惡性腫瘤轉(zhuǎn)移病灶，其存在是血行傳播的表現(xiàn)[4-5]。CTC 與直腸癌、乳腺癌、前列腺癌等多種腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)相關(guān)，是對惡性腫瘤患者無瘤生存預(yù)測的重要指標(biāo)[6]。本研究旨在分析CTC 檢測在根治性膀胱全切術(shù)后評估中的應(yīng)用價值，為臨床個體化治療方案的選擇提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年6月～2019年10月萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院門診就診，擬行根治性膀胱全切術(shù)的90 例膀胱癌患者作為研究組，選擇同期就診于萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院的10 例非腫瘤患者作為對照組。研究組中，男61 例，女29 例；年齡41～78 歲，平均（66.24±8.67）歲；腫瘤直徑≥3 cm 有38 例，＜3 cm 有52 例；多發(fā)腫瘤28 例，單發(fā)腫瘤62 例；鱗狀細(xì)胞癌1 例，單純尿路上皮癌77 例，尿路上皮癌合并小細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌1 例，尿路上皮癌合并鱗狀或腺樣分化11 例。對照組中，男6例，女4 例；年齡40～81 歲，平均（66.31±8.75）歲；腎盂輸尿管連接處狹窄3 例，結(jié)石6 例，精索靜脈曲張1 例。兩組患者的一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)： ①研究組患者均經(jīng)病理診斷確診為膀胱癌者；②美國麻醉醫(yī)師協(xié)會（ASA）分級為Ⅰ～Ⅲ級者；③術(shù)前未接受任何抗腫瘤治療者；④行根治性膀胱全切術(shù)治療者；⑤簽署知情同意書者；⑥對照組為非腫瘤患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤者；②術(shù)前發(fā)現(xiàn)存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者；③精神疾患者。

1.2 方法

采用用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝真空采血管采集兩組患者7.5 mL，24 h 內(nèi)富集處理?；靹蚝?，置入50 mL 離心管中，配置3 種工作液，命名為A1、B1、C1。加A1 至45 mL，室溫下行5 min 的1900 r/min 離心操作，去除血紅素、血紅蛋白。加入B1 混勻，裂解紅細(xì)胞，室溫下行5 min 的1900 r/min 離心操作，將紅細(xì)胞裂解基質(zhì)去除，所沉淀下來的即為稀有細(xì)胞和白細(xì)胞。吸取適量磁微粒，每份150 μL，混懸液置入2 mL的EP 管中，磁力架洗滌3 次。每份100 μL 比例在上述樣本中緩慢置入磁微粒，搖晃離心管，磁微粒充分混勻后，在搖床上搖動20 min，促使白細(xì)胞與磁珠結(jié)合。取3 mL C1 加入50mL 離心管，在頂層加入已處理好的樣本，按照密度梯度離心原理將磁珠和白細(xì)胞去除。行5 min 的1400 r/min 離心操作，吸取最上兩層溶液，放置在15 mL 離心管中，加入A1，行5 min的2300 r/min 離心操作，棄上清至300 μL。移動上述液體至2 mL 離心管，靠于磁力架2 min，將殘留磁珠去除，室溫下行3400 r/min 離心操作，棄上清至60 μL，滴加體積相等的固定液，混勻，涂片。取200 μL 固定液，使其完全覆蓋標(biāo)本區(qū)域，置于室溫下8 min。將固定液吸除，脫水，分別將10 μL CEP8 探針加入每個標(biāo)本區(qū)，蓋上蓋玻片。吸取200 μL 封片膠將玻片邊緣封住，加入載玻片放入雜交儀，變形76℃，5 min，雜交37℃，1.5 h。將標(biāo)本片取出，封片膠撕去，去除蓋玻片，洗片，染色，避光保存。利用熒光顯微鏡讀片，CTC 標(biāo)準(zhǔn)（圖1～4，封三）：CD45 陰性，F(xiàn)ISH 陽性（40 倍鏡下信號不分層，CEP8 探針信號≥3），單個細(xì)胞。

1.3 觀察指標(biāo)及評價標(biāo)準(zhǔn)

比較兩組CTC 陽性率，分析CTC 陽性率與膀胱癌患者臨床病理特征關(guān)系、CTC 表達(dá)水平與膀胱癌患者預(yù)后的關(guān)系。其中臨床病理特征包括性別、年齡、吸煙史、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目、組織學(xué)類型、腎積水、病理分級、T 分期、復(fù)發(fā)情況等。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，Log-rank檢驗(yàn)分別比較CTC 表達(dá)水平膀胱癌患者的生存差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者CTC 陽性率的比較

對照組中未檢出CTC，研究組中檢出CTC 有31例，陽性率為34.44%，CTC 數(shù)值為1～10 個。研究組CTC陽性率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.992，P=0.025）。

2.2 CTC 陽性率與膀胱癌患者臨床病理特征關(guān)系分析

不同性別、年齡、組織學(xué)類型和是否有吸煙史、腎積水患者CTC 陽性率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；多發(fā)腫瘤CTC 陽性率高于單發(fā)，腫瘤直徑≥3 cm 的CTC 陽性率高于＜3 cm 的CTC 陽性率，≥T2 分期CTC陽性率高于＜T2 分期的CTC 陽性率，高級別腫瘤的CTC 陽性率高于低級別腫瘤的CTC 陽性率，復(fù)發(fā)患者的CTC 陽性率高于無復(fù)發(fā)患者的CTC 陽性率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

表1 CTC 陽性率與膀胱癌患者臨床病理特征關(guān)系分析

2.3 CTC 表達(dá)水平與膀胱癌患者預(yù)后的關(guān)系

術(shù)后行長期定時隨訪，每3 個月復(fù)查隨訪一次。生存曲線顯示，CTC 陽性表達(dá)生存率高于無CTC 陽性表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖5）。

圖1 CD45 陰性（見內(nèi)文第124頁）

圖2 CEP8 陽性（見內(nèi)文第124頁）

圖3 細(xì)胞核（見內(nèi)文第124頁）

圖4 FISH 陽性細(xì)胞合成圖（見內(nèi)文第124頁）

圖5 CTC 表達(dá)與膀胱癌患者預(yù)后的關(guān)系

3 討論

膀胱癌是具有高復(fù)發(fā)、浸潤發(fā)展等特點(diǎn)的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，手術(shù)是治療膀胱癌的主要方式，但術(shù)后遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和高復(fù)發(fā)率是治療膀胱癌的主要問題之一[7]。約50%的浸潤性膀胱癌在確診時已發(fā)生微轉(zhuǎn)移灶。微轉(zhuǎn)移是機(jī)體體液、組織和細(xì)胞移植物中檢測到鏡下和亞顯微水平的腫瘤殘留，是隱匿于原發(fā)灶以外的組織、非血液系統(tǒng)的惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移，其發(fā)生與腫瘤組織學(xué)分級、腫瘤類型相關(guān)。微轉(zhuǎn)移灶的存在提示在臨床轉(zhuǎn)移癥狀出現(xiàn)之前，癌細(xì)胞在很長一段時間內(nèi)便與原發(fā)灶脫落播散至循環(huán)系統(tǒng)中，即CTC，是腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的最直接因素[8-11]。CTC 數(shù)量與術(shù)后總生存期和無病生存期關(guān)系密切，數(shù)量越多者術(shù)后復(fù)發(fā)率越大[12-13]。因此，檢測膀胱癌患者外周血腫CTC，對于評價膀胱癌療效和評估預(yù)后具有積極意義。

血液中CTC 的含量極其稀少，檢測CTC 前需實(shí)施富集，免疫磁珠法為常用的富集方法，包括陽性、陰性富集法，前者是讓帶有特異性抗體的免疫磁珠結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面抗原，形成復(fù)合物，促使腫瘤細(xì)胞在磁場中停留，但因部分腫瘤細(xì)胞無表達(dá)特異性抗原，易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。而陰性富集法是通過免疫磁珠結(jié)合非腫瘤細(xì)胞，使其在磁場中停留，通過磁場富集腫瘤細(xì)胞，檢出率更高[14-15]。本研究中，研究組的CTC 陽性率高于對照組；多發(fā)腫瘤的CTC 陽性率高于單發(fā)腫瘤的CTC 陽性率，腫瘤直徑≥3 cm 的CTC 陽性率高于＜3 cm 的CTC 陽性率，≥T2 分期的CTC 陽性率高于＜T2 分期的CTC 陽性率，高級別腫瘤的CTC 陽性率高于低級別腫瘤的CTC 陽性率，復(fù)發(fā)患者的CTC陽性率高于無復(fù)發(fā)患者的CTC 陽性率； 生存曲線顯示，CTC 陽性表達(dá)生存率高于無CTC 陽性表達(dá)患者，提示CTC 與膀胱癌的發(fā)生、進(jìn)展、預(yù)后密切相關(guān)。CTC檢測樣本易于獲取，具有易動態(tài)監(jiān)測、近似無創(chuàng)、高敏感性等優(yōu)點(diǎn)，與影像學(xué)和組織學(xué)比較，CTC 能更早發(fā)現(xiàn)腫瘤，動態(tài)監(jiān)測CTC 能間接反映腫瘤血行轉(zhuǎn)移速度、病情嚴(yán)重程度、治療后殘存腫瘤細(xì)胞，可能成為一種新型評價腫瘤療效和評估預(yù)后的手段，應(yīng)用前景廣泛。

綜上所述，CTC 與膀胱癌患者腫瘤數(shù)目、腫瘤直徑、病理分級、T 分期、復(fù)發(fā)密切相關(guān)，動態(tài)檢測CTC 利于及時評估療效、盡早發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和預(yù)后，指導(dǎo)臨床選擇和個體化、合理化的治療方案。