懷玉山高山馬鈴薯抗TMV蛋白基因的克隆和序列分析

洪森榮,曾曉健,魏 杰,溫倩文,謝 微,楊玉琪,姚 夢,易奧情,于小姣,蔡 紅,陳榮華

(1.上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,江西 上饒 334001；2.上饒市藥食同源植物資源保護(hù)與利用重點實驗室，江西 上饒 334001；3.上饒市薯芋類作物種質(zhì)保存與利用重點實驗室，江西 上饒 334001；4.上饒農(nóng)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新研究院，江西 上饒 334001；5.上饒市紅日農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司,江西 上饒 334700)

【研究意義】懷玉山高山馬鈴薯，俗名麻籽洋芋，營養(yǎng)全面，還原糖未檢出，非常適合三高人群輔助治療[1]。懷玉山高山馬鈴薯種植于海拔 500 m 以上高山環(huán)境，病害蟲較少，有利于生產(chǎn)無公害懷玉山高山馬鈴薯。2015年，中國啟動馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略，在此背景下，發(fā)展懷玉山高山馬鈴薯產(chǎn)業(yè)是保障糧食安全、促進(jìn)農(nóng)民增收又一選擇[2]。【前人研究進(jìn)展】馬鈴薯病毒病可引起種質(zhì)退化、產(chǎn)量下降、品質(zhì)變劣、商品性差，嚴(yán)重影響薯農(nóng)的經(jīng)濟(jì)效益[3]。煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus， TMV)是黑龍江馬鈴薯產(chǎn)區(qū)極易侵染的病毒，但江西馬鈴薯產(chǎn)區(qū)未檢出TMV[4]。研究表明，辣椒L基因控制TMV 抗性，引起細(xì)胞過敏性死亡[5]。另外，從杏毛頭鬼傘[6]、鮑菇[7]和榆黃蘑[8]中也篩選出抗煙草花葉病毒y3基因、xb68Ab蛋白和YP46-46蛋白，抗TMV活性較強(qiáng)，且煙草中抗TMV的N基因和 TMV 之間的互作以及N基因介導(dǎo)的抗病反應(yīng)和信號傳導(dǎo)也已探明[9-10]?！颈狙芯壳腥朦c】尹明華等[11]對懷玉山高山馬鈴薯進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)懷玉山高山馬鈴薯表達(dá)了抗TMV蛋白基因，這可能是TMV無法侵染懷玉山高山馬鈴薯的主要原因?！緮M解決的關(guān)鍵問題】目前，關(guān)于馬鈴薯抗馬鈴薯Y病毒(PVY)基因已經(jīng)克隆[12]，而關(guān)于馬鈴薯抗TMV蛋白基因的研究少見報道。本研究通過從構(gòu)建的懷玉山馬鈴薯轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中挑選抗TMV蛋白基因序列對其進(jìn)行克隆，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為分析懷玉山馬鈴薯抗TMV蛋白基因保守結(jié)構(gòu)域提供基礎(chǔ)資料，對進(jìn)一步揭示懷玉山馬鈴薯抗TMV蛋白的生物學(xué)功能提供理論依據(jù)，也為深入分析其它植物的抗TMV蛋白結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

懷玉山高山馬鈴薯試管苗由上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院植物組織培養(yǎng)室提供。

1.2 總 RNA 的提取和 cDNA 第一鏈的合成

用Trizol 試劑提取懷玉山高山馬鈴薯試管苗的總 RNA，提取步驟按說明書進(jìn)行，使用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 的濃度和完整性。以提取獲得的 RNA為模版，按照 M-MLV cDNA 第一鏈合成試劑盒說明書合成 cDNA 第一鏈。逆轉(zhuǎn)錄引物用 Oligo(dT) 18 Primer ：5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′，具體步驟按說明書進(jìn)行。

1.3 懷玉山高山馬鈴薯抗TMV蛋白基因基因的克隆

利用懷玉山高山馬鈴薯試管苗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫篩選出抗TMV蛋白基因的核心片段，運(yùn)用 Primer Premier 5.0 設(shè)計基因特異性引物(F:ATGGCATCATCTTCTTCTTCTTTTG；R:CTATAATCCCGAGCTTGTGGG)。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 2 min；【95 ℃ 30 s；56 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s】(35個循環(huán))；72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將含有目的基因的條帶與 pMD19-T 載體連接并用熱激法轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α， 經(jīng)鑒定正確的陽性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒送往上海生工進(jìn)行測序。

1.4 生物信息學(xué)分析

按照彭波等[13]的方法對懷玉山高山馬鈴薯抗TMV蛋白進(jìn)行氨基酸序列分析、理化性質(zhì)分析、結(jié)構(gòu)預(yù)測、功能分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 懷玉山高山馬鈴薯抗TMV蛋白一級結(jié)構(gòu)分析

2.1.1 懷玉山高山馬鈴薯抗TMV蛋白基因cDNA序列 懷玉山高山馬鈴薯抗TMV蛋白基因cDNA總長度為4335 bp(圖1)，G+C 含量為38.22 %(圖2)。

2.1.2 懷玉山高山馬鈴薯抗TMV蛋白氨基酸序列 Protparam預(yù)測顯示，懷玉山高山馬鈴薯抗TMV蛋白由1444個氨基酸組成(圖3)，分子量165 229.13 Da，等電點5.78，為親水性蛋白。各氨基酸的數(shù)目和比例為Ala (A,54，3.7 %)、Arg (R,62，4.3 %)、Asn (N,77，5.3 %)、Asp (D,88，6.1 %)、Cys (C,39，2.7 %)、Gln (Q,52，3.6 %)、Glu (E,112，7.8 %)、Gly (G,70，4.8 %)、His (H,40，2.8 %)、Ile (I,79，5.5 %)、Leu (L,211，14.6 %)、Lys (K,107，7.4 %)、Met (M,26，1.8 %)、Phe (F,64，4.4 %)、Pro (P,51，3.5 %)、Ser (S,145，10.0 %)、Thr (T,39，2.7 %)、Trp (W,18，1.2 %)、Tyr (Y,47，3.3 %)、Val (V,63，4.4 %)、Pyl (O,0，0.0 %)、Sec (U,0，0.0 %)。帶負(fù)電殘基總數(shù)(Asp+Glu)為200，正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)為169。原子組成：碳(C) 7381，氫(H) 11612，氮(N)1964，氧(O) 2205，硫(S) 65；分子式：C7381H11612N1964O2205S65，原子總數(shù)：23 227。摩爾消光系數(shù)以M-1cm-1為單位，在水中測量的280 nm處，Abs 0.1 %(=1 g/L)1.037，假設(shè)所有對半胱氨酸殘基形成胱氨酸，外系數(shù)171405；Abs 0.1 %(=1 g/L)1.023，假設(shè)所有Cys殘基均減少，外部系數(shù)169030。所考慮序列的N端是M(Met)，估計半衰期為30 h(哺乳動物網(wǎng)織紅細(xì)胞，體外)，>20 h(酵母，體內(nèi))，>10 h(大腸桿菌，體內(nèi))。不穩(wěn)定指數(shù)：失穩(wěn)指數(shù)(II)計算為42.64，這將蛋白質(zhì)歸類為不穩(wěn)定的。脂肪指數(shù)：94.72，總平均親水性為-0.319。

2.1.3 懷玉山高山馬鈴薯抗TMV蛋白親疏水性分析 從圖4可知，高峰值(正值)的區(qū)域表示疏水的區(qū)域，而負(fù)值的“低谷”區(qū)域是親水區(qū)域。疏水性結(jié)果分析表明，最大疏水值為2.5左右，說明該多肽該處的疏水性最強(qiáng);親水峰最大值為-3左右，整個蛋白質(zhì)表現(xiàn)出高度的親水性，說明該蛋白為親水性蛋白質(zhì)。

2.2 懷玉山高山馬鈴薯抗TMV蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)分析

懷玉山高山馬鈴薯抗TMV蛋白的二級結(jié)構(gòu)(圖5)預(yù)測如下：GOR 預(yù)測顯示其二級結(jié)構(gòu)由α-螺旋(Alphahelix，Hh，43.77 %)、β-片層(Extendedstrand，Ee，12.47 %)、無規(guī)則卷曲(Randomcoil，Cc，43.77 %) 構(gòu)成(圖6)。從分布位點上來看，C端含無規(guī)則卷曲和β-片層，N端含β-片層和α-螺旋，且無規(guī)則卷曲、β-片層和α-螺旋則散布于整個蛋白質(zhì)中。由于該蛋白質(zhì)未搜索到同源蛋白，無法進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)模擬。

2.3 懷玉山高山馬鈴薯抗TMV蛋白亞細(xì)胞定位

采用 Psort在線軟件對懷玉山高山馬鈴薯抗TMV蛋白基因的表達(dá)部位進(jìn)行預(yù)測(圖7)， 定位于細(xì)胞核中的數(shù)量為8，葉綠體中的數(shù)量為2，線粒體中的數(shù)量為2，細(xì)胞骨架中的數(shù)量為2，表明懷玉山高山馬鈴薯抗TMV蛋白主要存在細(xì)胞核中。

2.4 懷玉山高山馬鈴薯抗TMV蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

從構(gòu)建的進(jìn)化樹(圖8)中可見，懷玉山高山馬鈴薯與S.tuberosum(馬鈴薯)TMV resistance protein N-like isoform X1(類TMV抗性蛋白N亞型X1)、S.tuberosum(馬鈴薯)TMV resistance protein N-like isoform X2(類TMV抗性蛋白N亞型X2)、S.tuberosum(馬鈴薯)N-like putative resistance gene 2(類N假定抗性基因2)、S.tuberosum(馬鈴薯)TMV resistance protein N-like(類TMV抗性蛋白N)、S.lycopersicum(番茄)uncharacterized protein LOC101265700(非特征蛋白質(zhì) LOC101265700)、S.pennellii(野生種潘那利番茄)uncharacterized protein LOC107004430 isoform X1(非特征蛋白質(zhì) LOC107004430亞型X1)和S.pennellii(野生種潘那利番茄)uncharacterized protein LOC107004430 isoform X2(非特征蛋白質(zhì) LOC107004430亞型X2)在一個大分支下，這說明懷玉山高山馬鈴薯抗TMV蛋白在進(jìn)化上與馬鈴薯、番茄和野生種潘那利番茄的親緣關(guān)系較近，尤其是與S.tuberosum(馬鈴薯)TMV resistance protein N-like isoform X1(類TMV抗性蛋白N亞型X1)和S.tuberosum(馬鈴薯)TMV resistance protein N-like isoform X2(類TMV抗性蛋白N亞型X2)在進(jìn)化上具有最高的親緣關(guān)系。

3 討 論

煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)是煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)的代表種，主要危害煙草、番茄和馬鈴薯等作物[14]。研究表明，TMV侵染存在地理隔離[15]。通過生化手段，絞股藍(lán)抗TMV蛋白(gynostemmin)被分離，分子量20～30 kD，等電點>8.0，N端含19個氨基酸殘基(DINFSLAGADGQTYNTFIA)，是一種新的I型核糖體失活蛋白[16]。辣椒L基因決定了辣椒對TMV的抗性，L基因?qū)儆?CC-NBS-LRR(nucleotide-binding site-leucine-rich repeat)型R基因，具有NBS-LRR保守氨基酸序列[17]。煙草抗TMV基因N能編碼1個131.4 kDa的蛋白質(zhì)，無跨膜區(qū)域和信號序列，主要存在于細(xì)胞質(zhì)，其氨基末端結(jié)構(gòu)域與果蠅Toll蛋白和哺乳動物白細(xì)胞介素-1受體(IL-1R)的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域相似，是核苷酸結(jié)合位點(NBS)和4個不完全富含亮氨酸重復(fù)序列(LRR)，N、Toll和IL-1R序列的相似性表明，N通過Toll-IL-1樣途徑介導(dǎo)快速基因誘導(dǎo)和TMV抗性[18-19]。TMV侵染煙草后，克隆到1個抗性基因CN，與抗煙草花葉病毒基因N同源，編碼區(qū)(3423 bp)與抗TMV基因N的核苷酸同源性分別為93.63 %，CN屬于TIR/NBS/LRR基因類[20]。煙草中還克隆到1個NH基因，編碼區(qū)為5.028堿基對(bp)與N基因同源性為82.6 %，屬于TIR/NSB/LRR基因類[21]。在本試驗中，懷玉山高山馬鈴薯抗TMV蛋白由1444個氨基酸組成，分子量165 229.13 Da，等電點5.78，在進(jìn)化上與馬鈴薯、番茄和野生種潘那利番茄的親緣關(guān)系較近，尤其是與Solanumtuberosum(馬鈴薯)TMV resistance protein N-like isoform X1(類TMV抗性蛋白N亞型X1)和Solanumtuberosum(馬鈴薯)TMV resistance protein N-like isoform X2(類TMV抗性蛋白N亞型X2)在進(jìn)化上具有最高的親緣關(guān)系。說明，懷玉山高山馬鈴薯抗TMV蛋白基因與絞股藍(lán)抗TMV蛋白不同，但與煙草抗TMV蛋白基因 N同源性較高。本研究克隆的懷玉山高山馬鈴薯抗TMV蛋白是懷玉山高山馬鈴薯首次報道的蛋白類活性物質(zhì)。它的克隆有助于加強(qiáng)懷玉山高山馬鈴薯研究和開發(fā)的力度。

4 結(jié) 論

懷玉山高山馬鈴薯抗TMV蛋白具有典型抗TMV蛋白的結(jié)構(gòu)特征，氨基酸序列及核酸序列與同源物種相似度高，在進(jìn)化上高度保守，對進(jìn)一步揭示該蛋白生物學(xué)功能具有重要意義。