寧夏春小麥種質(zhì)資源Wx基因分子鑒定及其分布

亢 玲，李瑞博，王小亮，張維軍，何進(jìn)尚，陳東升

(1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)作物研究所，寧夏銀川 750004； 2.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

顆粒結(jié)合淀粉合成酶(granule-bound starch synthese ,GBSS)是直鏈淀粉合成途徑中的關(guān)鍵酶，又稱為Waxy蛋白(簡稱Wx蛋白)。普通小麥(TriticumaestivumL.)Wx蛋白由Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1三個(gè)蛋白亞基組成，分別由位于7AS染色體上的Wx-A1基因、4AL染色體上的Wx-B1基因和7DS染色體上的Wx-D1基因所編碼[1]。小麥淀粉由直鏈和支鏈淀粉兩種類型組成，二者的含量與比例影響小麥淀粉的理化特性，最終決定小麥面粉的用途[2]。Wx蛋白亞基的缺失及組合類型不同，其直鏈淀粉含量存在明顯差異。陳東升等[3]研究表明，Wx蛋白缺失類型對直鏈淀粉含量的效應(yīng)依次為：Wx-Al、Wx-Bl和Wx-Dl全缺失>Wx-Bl和Wx-Dl缺失>Wx-Al和Wx-B1缺失>Wx-Al和Wx-Dl缺失>Wx-B1缺失≈Wx-Dl缺失>Wx-A1缺失。當(dāng)3個(gè)Wx蛋白全部缺失時(shí)，直鏈淀粉含量接近于零，即為糯小麥。前人研究表明，不同Wx蛋白亞基缺失類型的小麥具有不同的加工用途，Wx-Bl亞基缺失的小麥品種，其直鏈淀粉含量為22.3%，更適合制作優(yōu)質(zhì)面條；Wx-Al、Wx-Bl和Wx-Dl亞基全缺失的小麥品種，其直鏈淀粉含量幾乎為零，可形成全糯小麥，可做配粉滿足不同面制品加工的需要，有利于制作速凍和冷凍食品，也會延長面包等制品的貨架壽命[4-7]。因此，分析和鑒定Wx基因在寧夏春小麥種質(zhì)資源中的分布規(guī)律，對選育和改良優(yōu)質(zhì)面條小麥品種具有重要意義。

寧夏是我國春小麥生產(chǎn)的重要地區(qū)之一，面條是寧夏傳統(tǒng)主食之一。近年來，寧夏育種者主要以小麥產(chǎn)量和蛋白品質(zhì)為研究重點(diǎn)，而對小麥的淀粉品質(zhì)研究較少，對寧夏春小麥種質(zhì)資源中Wx等位基因的變異與分布情況還不清楚。因此，本研究利用已開發(fā)的Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1基因分子標(biāo)記，對寧夏春小麥種質(zhì)資源淀粉品質(zhì)基因Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1進(jìn)行鑒定和評價(jià)，了解其變異類型和分布狀況，篩選Wx基因缺失的種質(zhì)資源，以期為該地區(qū)和我國相關(guān)春麥區(qū)選育優(yōu)質(zhì)面條小麥品種提供種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 材料來源

參試材料為299個(gè)寧夏春小麥種質(zhì)資源，包括地方品種11個(gè)，審定品種45個(gè)，引進(jìn)品種12個(gè)，高代品系231個(gè)，代表了寧夏春小麥生產(chǎn)和育種的現(xiàn)狀。對照材料有4個(gè)，分別為中國春、陜糯1號(Wx-A1、Wx-B1、Wx-D1缺失)、Kanto107(Wx-A1、Wx-B1缺失)和白火麥(Wx-D1缺失)。

1.2 基因組DNA的提取

試驗(yàn)材料在恒溫培養(yǎng)箱中育苗，剪取單株的新鮮嫩葉，利用CTAB法提取基因組DNA[8]，重復(fù)3次，用于Wx基因的檢測。

1.3 STS標(biāo)記的選擇

每個(gè)Wx基因位點(diǎn)均選用2個(gè)分子標(biāo)記分別進(jìn)行獨(dú)立檢測，二者結(jié)果進(jìn)行相互驗(yàn)證以保證最終結(jié)果的可靠性，所用引物見表1。標(biāo)記PA1和PA2用來檢測Wx-A1位點(diǎn)的變異，標(biāo)記PB1和PB2用來檢測Wx-B1位點(diǎn)的變異，標(biāo)記PD1和PD2用來檢測Wx-D1位點(diǎn)的變異。除PB1和PB2是顯性STS標(biāo)記外，其余4個(gè)均為共顯性STS標(biāo)記，引物序列由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

表1 檢測目標(biāo)基因的引物序列及其擴(kuò)增片段長度Table 1 Sequences and amplified fragment sizes of the primer for targeted genes

共顯性標(biāo)記擴(kuò)增得到相應(yīng)的目標(biāo)條帶，則屬于相對應(yīng)的變異類型。例如，利用PA1標(biāo)記在Wx-A1基因位點(diǎn)擴(kuò)增得到389 bp條帶，則屬于野生型；擴(kuò)增得到370 bp條帶，則屬于突變型(Wx-A1基因缺失)。顯性標(biāo)記擴(kuò)增基于有無目標(biāo)條帶進(jìn)行判斷。例如，利用PB1標(biāo)記對Wx-B1基因位點(diǎn)擴(kuò)增得到425 bp條帶，則屬于野生型；若無目標(biāo)條帶，則屬于突變型(Wx-B1基因缺失)。

1.4 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括2×Es Taq MasterMix(Dye)(北京康為世紀(jì)生物科技公司)10 μL，10 μmol·L-1的上、下游引物各0.8 μL，10 μmol·L-1的模板DNA 1.5 μL，用ddH2O補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55～70 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，34個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

1.5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測

(1)Wx-D1位點(diǎn)基因的檢測：加6 μL Loading buffer溶于擴(kuò)增產(chǎn)物中，取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用 1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，用4S Green Plus 無毒核酸染料(上海生工)膠染法染色，所用電泳緩沖液為0.5×TAE，在130 V恒壓下電泳25 min，用紫外成像系統(tǒng)UVP上觀察拍照。

(2)Wx-A1和Wx-B1位點(diǎn)基因的檢測：擴(kuò)增產(chǎn)物在5%的變性聚丙烯酰胺上分離，電泳緩沖液為1×TBE，100 W恒定功率電泳30 min，溫度上升到35 ℃時(shí)，在點(diǎn)樣孔中加入變性的擴(kuò)增產(chǎn)物4 μL,對照Marker DL500(Takara)3 μL，60 W恒定功率電泳1 h，銀染法顯色后用紫外燈觀察，統(tǒng)計(jì)結(jié)果并保留圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 Wx-A1位點(diǎn)的檢測結(jié)果

利用標(biāo)記PA1和PA2鑒定寧夏春小麥種質(zhì)資源Wx-A1基因位點(diǎn)的多態(tài)性。部分材料的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果如圖1所示，白禿子等297個(gè)材料與對照中國春一樣，分別擴(kuò)增出389 bp 和336 bp的目的條帶，表明其基因型為Wx-A1a；18A5009和18A4328兩個(gè)材料與對照陜糯1號一樣，分別擴(kuò)增出370 bp和317 bp的目的條帶，表明這兩個(gè)材料的基因型為Wx-A1b。

2.2 Wx-B1位點(diǎn)的檢測結(jié)果

利用標(biāo)記PB1和PB2鑒定寧夏春小麥種質(zhì)資源Wx-B1基因位點(diǎn)的多態(tài)性。部分材料的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果如圖2所示，白禿子、山麥等267個(gè)材料與對照中國春一樣，擴(kuò)增出425 bp和440 bp的目的條帶，表明其基因型為Wx-B1a；76N556等32個(gè)材料與對照關(guān)東107一樣，均未擴(kuò)增出目的條帶，表明其基因型為Wx-B1b。

2.3 Wx-D1位點(diǎn)的檢測結(jié)果

利用標(biāo)記PD1和PD2鑒定299個(gè)寧夏春小麥種質(zhì)資源中Wx-D1基因位點(diǎn)的多態(tài)性。部分材料的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果如圖3所示，白禿子、紅齊麥等297個(gè)材料與對照中國春一樣，分別擴(kuò)增出867 bp和1 400 bp的目的條帶，表明其基因型為Wx-D1a；18A4224和18A4327兩個(gè)材料與對照白火麥一樣，分別擴(kuò)增出279 bp和800 bp的目的條帶，表明這兩個(gè)材料的基因型為Wx-D1b。

2.4 寧夏春小麥種質(zhì)資源Wx基因的組成與分布規(guī)律

從表2可以看出，299個(gè)寧夏春小麥種質(zhì)資源中，Wx基因組成以野生型(Wx-A1a/Wx-B1a/Wx-D1a)為主，占參試材料總數(shù)的88.3%。在Wx-A1位點(diǎn)上，野生型Wx-A1a的品種(系)有297個(gè)，占參試材料總數(shù)的99.3%；突變型Wx-A1b的材料有2個(gè)，占參試材料總數(shù)的0.7%，分別為18A5009(06G52/寧春33號)和18A4328(永2602/揚(yáng)糯麥1號)。在Wx-B1位點(diǎn)上，野生型Wx-B1a的品種(系)有267個(gè)，占參試材料總數(shù)的89.3%；突變型Wx-B1b的品種(系)有32個(gè)，占參試材料總數(shù)的10.7%，其中地方品種中有1個(gè)材料(和尚頭)的基因型為Wx-B1b，占地方品種數(shù)的9.1%；審定品種中有4個(gè)材料的基因型為Wx-B1b，占審定品種數(shù)的8.9%，分別為寧春1號、寧春7號、寧春27號、寧春49號；自育高代品系有27個(gè)材料的基因型為Wx-B1b，占自育高代品系數(shù)的11.7%，分別為18A5004、18A5010、18A4328等。其中18A4328(永2602/揚(yáng)糯麥1號)的基因型為Wx-A1b/Wx-B1b。在Wx-D1位點(diǎn)上，野生型Wx-D1a的品種(系)有297個(gè)，占參試材料總數(shù)的99.3%；突變型Wx-D1b的品種(系)有2個(gè)，占參試材料總數(shù)的0.7%，為優(yōu)選自育高代品系，分別為18A4224(寧春40號/永2602//寧春33號)和18A4327(永2602/揚(yáng)糯麥1號)。

表2 299個(gè)寧夏春小麥種質(zhì)資源Wx基因的組成與分布頻率Table 2 Composition and frequencies of Wx genes in ningxia 299 wheat germplasm resources

3 討 論

Wx蛋白直接影響小麥籽粒中直鏈淀粉含量的高低，進(jìn)而會影響小麥面粉的上漿粘度、膨脹度和糊化特性，最終決定小麥面粉的用途。已有研究證實(shí)，Wx蛋白有Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1三個(gè)亞基，且在自然群體中存在有3個(gè)蛋白亞基的缺失類型；3個(gè)蛋白亞基同時(shí)缺失會造成小麥籽粒直鏈淀粉含量極低，表現(xiàn)為全糯小麥，這種面粉制作的面包具有多孔、膠粘而且容易變形的特點(diǎn)，制作出的面條易碎、柔軟且無法保持結(jié)構(gòu)；一個(gè)或兩個(gè)蛋白亞基缺失會引起籽粒中直鏈淀粉含量在一定程度上的降低，表現(xiàn)為部分糯小麥，這種面粉具有較高的上漿粘度、膨脹度和較好的糊化特性，制成的面條質(zhì)地柔軟且粘性強(qiáng)[3，5]。

本研究表明，寧夏春小麥種質(zhì)資源Wx基因的組成以野生型(Wx-A1a/Wx-B1a/Wx-D1a)為主，突變型Wx-B1b的頻率相對較高，而突變型Wx-A1b和Wx-D1b的頻率較低。徐兆華等[12]和杜小燕等[13]的分析結(jié)果表明，我國小麥種質(zhì)資源中Wx蛋白亞基類型主要以單亞基缺失為主，并且主要為Wx-B1缺失類型，兼有Wx-A1和Wx-B1缺失類型。這一結(jié)論與寧夏春小麥Wx蛋白亞基的鑒定結(jié)果比較一致。

何中虎[14]和劉建軍等[15]研究表明，中國小麥品種中Wx-B1蛋白缺失的頻率較高，缺失Wx-B1亞基的小麥品種面粉除了表現(xiàn)出直鏈淀粉較低的特點(diǎn)，而且面粉的高峰粘度大、膨脹勢高、用該類型面粉制作加工的面條品質(zhì)優(yōu)良。因此，Wx-B1缺失常作為優(yōu)質(zhì)面條小麥品種選育的生化指標(biāo)。299個(gè)寧夏春小麥種質(zhì)資源中，突變型Wx-B1b頻率的較高，占參試材料總數(shù)的10.7%，其中地方品種占0.3%，引進(jìn)品種占0.7%，審定品種占1.3%，自育高代品系占9.0%。說明通過小麥育種選擇，新品種和高代品系中Wx-B1b類型逐步增加。原因可能是：一方面寧夏春小麥種質(zhì)資源中通過引進(jìn)和不斷培育優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源，使得該亞基類型的分布頻率逐漸增加；另一方面人們對品質(zhì)改良的重視程度在逐漸增加，育種目標(biāo)除了重視傳統(tǒng)產(chǎn)量及抗性之外，開始兼顧品質(zhì) 改良。

寧夏引黃灌區(qū)主要生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)硬紅春小麥，面條品質(zhì)改良是小麥育種的主攻目標(biāo)。不同Wx蛋白亞基缺失降低小麥直鏈淀粉含量，導(dǎo)致淀粉糊化和膨脹特性的改變，影響面條品質(zhì)。部分糯質(zhì)小麥淀粉特性表現(xiàn)出的糊化粘度、稀懈值和膨脹勢特征也各不相同，需要進(jìn)一步篩選或者培育出最適宜用于制做中國面條的種質(zhì)資源。因此，在今后育種中，應(yīng)該重視小麥優(yōu)質(zhì)亞基和品質(zhì)相關(guān)性的基礎(chǔ)理論研究、同時(shí)在傳統(tǒng)育種工作中引入分子生物學(xué)手段，提高優(yōu)質(zhì)基因或亞基的篩選效率，從而加速優(yōu)質(zhì)面條小麥品種選育的工作。