巨噬細(xì)胞表達(dá)基因在中耳膽脂瘤病理過程中的作用

方練，陳霖，林碧

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325015；1.耳鼻咽喉科；2.病理科

中耳膽脂瘤是顳骨內(nèi)角質(zhì)化細(xì)胞異常增生性病變，是上皮細(xì)胞強(qiáng)烈增殖、角蛋白碎屑大量堆積形成的上皮樣囊袋[1-2]，膽脂瘤侵襲性生長(zhǎng)可破壞周圍骨質(zhì)，導(dǎo)致各種顱內(nèi)外并發(fā)癥，如迷路炎、周圍性面癱和腦膿腫等[3-4]。膽脂瘤中的免疫細(xì)胞釋放炎癥遞質(zhì)，導(dǎo)致咽鼓管功能障礙和中耳黏膜纖毛清除功能減退，中耳細(xì)菌產(chǎn)物堆積，造成感染的惡性循環(huán)。膽脂瘤的異常增殖可能與過度炎癥有關(guān)，其具體分子機(jī)制目前尚不明確。

巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫的關(guān)鍵組成部分，能夠辨認(rèn)共生抗原，清除病原體和代謝物，維持組織穩(wěn)態(tài)，如果這一過程被破壞，將產(chǎn)生過度的免疫反應(yīng)，促進(jìn)組織炎癥的發(fā)生和發(fā)展，可能導(dǎo)致上皮增殖失控和膽脂瘤生成[5]。

不同部位的巨噬細(xì)胞具有轉(zhuǎn)錄和功能差異，并由其基因表達(dá)譜所決定[6]。本研究通過RNA-Seq方法[7]檢測(cè)中耳膽脂瘤巨噬細(xì)胞的基因表達(dá)譜，篩選出差異表達(dá)基因，探討其在中耳膽脂瘤中的生物學(xué)功能及信號(hào)通路。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2018年1月至12月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科行乳突切除術(shù)的慢性化膿性中耳炎患者共57例，經(jīng)手術(shù)探查及HE染色病理檢查，其中12例為中耳膽脂瘤，45例為非膽脂瘤型中耳炎。術(shù)中分別收集中耳膽脂瘤患者的膽脂瘤基質(zhì)周圍組織和非膽脂瘤型中耳炎患者的中耳肉芽組織。隨機(jī)抽取3例中耳膽脂瘤標(biāo)本為試驗(yàn)組，3例非膽脂瘤型中耳炎標(biāo)本為對(duì)照組。

1.2 方法

1.2.1 組織巨噬細(xì)胞分離：將收集的標(biāo)本組織切成小塊，在37 ℃ Hank’s液中孵化30 min。用細(xì)胞濾網(wǎng)采取吸液和機(jī)械分離的方式得到單細(xì)胞懸液。用抗人CD14免疫磁珠抗體（購自美國(guó)BD公司） 標(biāo)記巨噬細(xì)胞，置于BD IMag的磁場(chǎng)中，CD14+細(xì)胞因向磁體遷移而得以分離，重復(fù)分離2次后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD14+細(xì)胞的百分比。

1.2.2 總RNA提取、文庫構(gòu)建：用Hank’s液調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至105～106/mL，使用總RNA提取試劑盒（購自南京諾維贊生物科技有限公司）從每個(gè)樣本中提取總RNA，使用RNA-Seq文庫制備試劑盒（購自南京諾維贊生物科技有限公司），用磁珠捕獲并片段化mRNA，隨機(jī)引物合成cDNA第一鏈，修復(fù)cDNA末端，將Illumina接頭連接到cDNA，選取cDNA 200～300 bp片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR循環(huán)數(shù)在12～17次之間，獲得大約2 μg的PCR產(chǎn)物，用DNA清潔珠純化PCR產(chǎn)物，于-70 ℃冰箱保存。

1.2.3 測(cè)序分析：通過Illumina平臺(tái)對(duì)cDNA進(jìn)行測(cè)序，每個(gè)樣本獲得平均5 000萬個(gè)150 bp片段的原始數(shù)據(jù)。對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾和質(zhì)量檢查，轉(zhuǎn)換成有效讀段，映射到人類參考基因組，組裝轉(zhuǎn)錄本并計(jì)算基因讀數(shù)。對(duì)讀數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以每千堿基對(duì)百萬片段（FPKM）代表基因表達(dá)水平[8]。

1.3 結(jié)果分析

1.3.1 全基因組差異表達(dá)分析：基于FPKM的差異倍數(shù)對(duì)數(shù)值（log2FC），比較兩組間基因的表達(dá)水平，P＜0.05被篩選為差異基因。用Pheatmap軟件繪制基因表達(dá)熱圖，按基因表達(dá)量排序，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）分析，按分子功能、細(xì)胞成分和生物學(xué)過程分為三個(gè)層次。利用cluster Profiler軟件對(duì)差異表達(dá)基因的信號(hào)通路進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析[9]。按基因表達(dá)量排序，生成一個(gè)矩陣，用基因集富集分析（gene set enrichment analysis， GSEA）方法對(duì)兩組基因進(jìn)行全面比較[10]。再通過Cytoscape軟件[11]繪制GO相互作用網(wǎng)絡(luò)圖[12]，可視化GSEA結(jié)果，去除冗余信息，獲得清晰結(jié)果。

1.3.2 RT-PCR和qPCR驗(yàn)證：采用RT-PCR法對(duì)差異表達(dá)量靠前的5個(gè)基因進(jìn)行驗(yàn)證，總RNA分離、cDNA第一鏈合成和q PCR（熒光定量試劑盒購自日本Takara 公司）的實(shí)驗(yàn)步驟按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。在PCR儀上進(jìn)行35次循環(huán)，采用2ΔΔCt計(jì)算法，標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)值，GAPDH為引物的參考基因[13]。

2 結(jié)果

2.1 熱圖分析 根據(jù)熱圖顯示，在表達(dá)量大于1 FPKM的5 342個(gè)基因中，124個(gè)基因顯示表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05）。表達(dá)上調(diào)排前的基因包括肌蛋白（musculin，MSC）、IgA受體Fc片段（Fc fragment of IgA receptor，F(xiàn)CAR）、受體A5樣白細(xì)胞免疫球蛋白（leukocyte immunoglobulin like receptor A5，LILRA5）和基質(zhì)金屬蛋白酶7（matrix metalloperptidase 7，MMP-7）等，見圖1。此外，有66個(gè)基因顯示表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05，見圖2）。

2.2 功能分析 為了研究差異基因是否參與中耳膽脂瘤的發(fā)病過程，對(duì)表達(dá)上調(diào)基因進(jìn)行GO功能注釋，將它們分為41組（P＜0.01，見表1、圖3）。通過GSEA和GO相互作用分析，發(fā)現(xiàn)差異基因的功能主要集中于B細(xì)胞和T細(xì)胞免疫、中性粒細(xì)胞功能和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulatory protein kinases，ERK）信號(hào)的負(fù)調(diào)控等。

圖1 熱圖顯示中耳膽脂瘤巨噬細(xì)胞內(nèi)124個(gè)表達(dá)上調(diào)基因

圖2 熱圖顯示中耳膽脂瘤巨噬細(xì)胞內(nèi)66個(gè)表達(dá)下調(diào)基因

表1 排名前十的表達(dá)上調(diào)基因及其GO分組和生物學(xué)功能

表達(dá)上調(diào)基因FCAR位于8個(gè)GO組，主要與中性粒細(xì)胞激活、脫顆粒、FCAR介導(dǎo)免疫和三級(jí)顆粒等功能有關(guān)。白細(xì)胞免疫球蛋白樣受體位于4個(gè)GO組，與腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）的生成有關(guān)?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）如MMP-7、MMP-9和MMP-12基因表達(dá)明顯上調(diào)，參與了降解細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）蛋白的生物學(xué)過程。

66個(gè)表達(dá)下調(diào)基因位于54個(gè)GO組，主要影響核糖體功能、線粒體ATP合成和呼吸鏈復(fù)合體裝配，見表2、圖4。

圖3 GO功能分析顯示所有表達(dá)上調(diào)基因分布在41個(gè)GO組

表2 排名前十的表達(dá)下調(diào)基因及其GO分組和生物學(xué)功能

2.3 信號(hào)通路分析 為了明確差異基因?qū)?xì)胞功能的影響，對(duì)表達(dá)上調(diào)基因進(jìn)行了KEGG信號(hào)通路分析，發(fā)現(xiàn)上述基因主要信號(hào)通路富集于與感染和炎癥有關(guān)的信號(hào)通路，包括大腸桿菌和金黃色葡萄球菌感染，TNF、溶酶體和趨化因子的信號(hào)通路，它們代表著炎癥信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)以及對(duì)病原體的吞噬 作用。

3 討論

在中耳炎癥時(shí)，先天免疫系統(tǒng)檢測(cè)到病原體相關(guān)的分子模式（PAMPS）和損傷相關(guān)分子模式（DAMPS），激活炎癥相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)血液循環(huán)中的中性粒細(xì)胞募集至中耳炎癥部位。浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞分泌一些趨化因子招募炎癥單核細(xì)胞至炎癥部位[14]，這些單核細(xì)胞會(huì)加速轉(zhuǎn)變成巨噬細(xì)胞，其主要生物學(xué)功能是慢性感染和免疫應(yīng)答[15]，可能在中耳膽脂瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，因此，篩選與巨噬細(xì)胞生物學(xué)功能相關(guān)的關(guān)鍵基因和分子通路對(duì)于闡明中耳膽脂瘤的發(fā)病機(jī)制十分重要。

圖4 GO功能分析顯示所有表達(dá)下調(diào)基因分布于54個(gè)GO組

本研究通過對(duì)中耳膽脂瘤巨噬細(xì)胞的RNA測(cè)序，篩選出124個(gè)表達(dá)上調(diào)基因， 結(jié)合GO功能分析，發(fā)現(xiàn)表達(dá)上調(diào)基因主要位于B細(xì)胞和T細(xì)胞免疫、中性粒細(xì)胞活化等組，提示中耳膽脂瘤巨噬細(xì)胞通過差異基因主要調(diào)控中耳炎癥和免疫程度。例如，肌凝蛋白是一個(gè)基本的螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子基因，也被稱為活化的B細(xì)胞因子-1，能調(diào)節(jié)抗原依賴的B細(xì)胞分化[16]和促進(jìn)外周Treg細(xì)胞單向發(fā)育[17]，這些免疫細(xì)胞能分泌或誘導(dǎo)角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生多種炎癥遞質(zhì)，與炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量和感染嚴(yán)重程度密切相 關(guān)[18]。另外，F(xiàn)CAR屬于免疫球蛋白超家族成員，其膜外區(qū)由206個(gè)氨基酸組成，與IgA結(jié)合，使IgA免疫復(fù)合物在髓系細(xì)胞中觸發(fā)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生多種細(xì)胞效應(yīng)，如內(nèi)吞作用、吞噬作用、抗體依賴或細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和刺激細(xì)胞因子釋放，尤其在黏膜表面的抗感染免疫中發(fā)揮重要作用。通過KEGG信號(hào)通路分析，發(fā)現(xiàn)這些上調(diào)基因參與的溶酶體、致病性大腸桿菌感染、金黃色葡萄球菌感染、TNF信號(hào)通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、B細(xì)胞受體等信號(hào)通路，能放大中耳的促炎反應(yīng)，趨化其他免疫細(xì)胞參與反應(yīng)，增強(qiáng)中耳炎癥過程，許多炎癥細(xì)胞因子如TNF、IL-8、IL-1α等在增強(qiáng)膽脂瘤細(xì)胞增殖能力和激活破骨細(xì)胞方面起重要作用[19]，這說明巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的慢性細(xì)菌感染和信號(hào)級(jí)聯(lián)放大可能與中耳膽脂瘤上皮細(xì)胞異常增殖和骨質(zhì)破壞有關(guān)。

中耳膽脂瘤由囊內(nèi)容物、基質(zhì)、基質(zhì)外層三部分構(gòu)成，基質(zhì)包括形成囊壁結(jié)構(gòu)的角化的鱗狀上皮，巨噬細(xì)胞表達(dá)上調(diào)基因（如角蛋白-13、MMPs）直接參與調(diào)控膽脂瘤角化鱗狀上皮增殖和基質(zhì)重構(gòu)。角蛋白-13是上皮細(xì)胞中間絲細(xì)胞骨架的主要成分，具有維持皮膚最外層上皮細(xì)胞完整性和正常功能的作用，直接參與細(xì)胞的分裂、分化及凋亡等過程[20]。本研究顯示角蛋白-13在中耳膽脂瘤基質(zhì)中表達(dá)上調(diào)，提示角質(zhì)形成細(xì)胞處于低分化狀態(tài)，具有較高的增殖和遷移能力，影響原上皮和組織結(jié)構(gòu)的穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致角蛋白碎屑和代謝物堆積。以往對(duì)角蛋白的研究還表明，它們與TNF-α、IL-1β等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)之間存在著功能聯(lián)系，參與激活破骨細(xì)胞，可能是膽脂瘤侵襲骨質(zhì)的原因之一[21]。還有研究發(fā)現(xiàn)隨著膽脂瘤分期的進(jìn)展，角蛋白-13在外耳道基底上層的表達(dá)會(huì)逐漸增強(qiáng)，說明角蛋白-13與中耳膽脂瘤的病理過程密切相關(guān)[22]。MMPs是一種鋅鈣依賴的肽鏈內(nèi)切酶，在生理情況下表達(dá)水平極低，而在炎癥因子和氧化應(yīng)激等情況下表達(dá)顯著上調(diào)。它通過降解ECM和促進(jìn)ECM重構(gòu)[23]，影響角質(zhì)上皮細(xì)胞的增殖、遷移和分化[24]。研究發(fā)現(xiàn)，中耳膽脂瘤的侵襲能力與MMP-13表達(dá)平均光密度顯著相關(guān)，MMP-13能降解骨基質(zhì)內(nèi)的膠原引起骨質(zhì)破壞，說明其在中耳膽脂瘤骨破壞中發(fā)揮重要作用[25]。MMP-7的作用底物更為廣泛，包括ECM底物，如IV型膠原、明膠、纖連蛋白，以及具有特殊生物學(xué)活性的各種分子，如β4-整合素、E-鈣黏蛋白、TNFα前體，MMP-7通過激活這些底物，破壞細(xì)胞完整性和相互連接，導(dǎo)致基質(zhì)重構(gòu)和上皮遷移，本研究證實(shí)MMP-7在中耳膽脂瘤中高表達(dá)，可能與中耳膽脂瘤上皮增殖、骨質(zhì)破壞等有關(guān)。

綜上所述，本研究篩選出中耳膽脂瘤巨噬細(xì)胞的差異表達(dá)基因，這些基因富集于炎癥和免疫反應(yīng)相關(guān)信號(hào)通路；角蛋白-13、MMPs是影響細(xì)胞增殖和骨質(zhì)破壞的關(guān)鍵基因，在中耳膽脂瘤的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要作用。