超聲造影定量分析在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌預(yù)后評估中的應(yīng)用

左文思，葛妍，黃思，劉新橋

1南華大學(xué)附屬長沙市中心醫(yī)院超聲診斷科，湖南長沙 410000；2新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院超聲科，新疆烏魯木齊830011

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，患病率和病死率均呈上升趨勢，早期預(yù)測患者的預(yù)后有助于制定個體化和檢測治療效果［1］。經(jīng)典的預(yù)后因素，包括淋巴結(jié)狀態(tài)、腫瘤直徑和組織學(xué)分級已經(jīng)用于預(yù)測乳腺癌的預(yù)后復(fù)發(fā)和總生存率［2］。乳腺癌患者中雌激素受體（ER）和孕激素受體（PR）的表達可幫助醫(yī)生確定患者是否應(yīng)接受抗激素治療。ER和PR表達的缺失通常表明預(yù)后較差［3］。Her-2、Ki-67是可能有助于反映腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力的生物標記物，并以證明與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移有關(guān)［4］。目前，為了診斷這些病理預(yù)后因素和生物標記物，需要組織學(xué)標本。因此，在術(shù)前進行超聲造影檢查，可以提供與這些因素高度相關(guān)的信息，這對乳腺癌患者的早期治療非常有幫助。探索超聲造影特點和乳腺癌病理預(yù)后之間的相關(guān)性是近來研究熱點，但是大部分研究僅僅分析了定性的超聲造影特點，認為部分定性超聲造影特征與預(yù)后因素有一定的相關(guān)性［5-9］。只有很少研究分析了定量超聲造影特性，研究顯示了混合的結(jié)果，并在患者的人群、研究設(shè)計、統(tǒng)計分析等方面存在差異［10］，且超聲造影定量分析是否可用于非侵襲性識別高度侵襲性乳腺癌尚不清楚。本研究目的是研究乳腺癌患者定量超聲造影特征與病理預(yù)后因素的相關(guān)性。并運用ROC曲線分析的方法評價各類不同的超聲造影定量參數(shù)，為臨床評估浸潤性乳腺癌預(yù)后提供有力的輔助手段。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析我院2019年1月～2020年5月符合以下標準的患者，納入標準：經(jīng)手術(shù)證實為浸潤性導(dǎo)管乳腺癌；術(shù)后經(jīng)免疫組化檢測和獲得相關(guān)預(yù)后指標；術(shù)前進行了超聲造影檢查；在超聲造影前未行化療、放療及其它抗腫瘤治療。排除標準：缺乏完整的組織病理學(xué)結(jié)果；非浸潤性導(dǎo)管乳腺癌；圖像質(zhì)量差，不能用于觀察分析。最終共有110例乳腺癌患者納入研究，均為女性，年齡24～74 歲（49.05±11.32 歲）；病灶最大直徑1.3～3.7 cm（2.85±1.40 cm）。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，所有患者均簽署造影知情同意書。

1.2 方法

采用Philips iU22超聲診斷儀，頻率為3～9 MHz，脈沖反向諧波造影條件，機械指數(shù)0.07。超聲造影劑為Sono Vue，用5 mL生理鹽水將造影劑配成六氟化硫微泡混懸液，連續(xù)振蕩30 s備用。常規(guī)超聲獲得較好的病灶的二維圖像，選最佳切面，轉(zhuǎn)換為超聲造影模式，呈現(xiàn)出實時圖像；抽取4.8 mL六氟化硫微泡混懸液進肘正中靜脈迅速推注，而后快速注入5 mL生理鹽水，啟動計時器，觀察造影劑進入周圍正常組織及病灶的動態(tài)過程，掃描過程存儲3 min的連續(xù)動態(tài)圖像到機器硬盤中，所有圖像由2名資深的超聲科醫(yī)師盲法閱片。采用機器配備的QLAB分析軟件定量分析病灶，選取病灶邊緣區(qū)域和周邊正常組織作為感興趣區(qū)（圖1），得出時間-強度曲線，進行曲線擬合得到時間-強曲線量化參數(shù)，包括病灶邊緣區(qū)域及病灶周圍正常組織的峰值強度（PI）、達峰時間（TTP）、上升時間（RT）、平均渡越時間（MTT）。PI為造影過程中最高峰時造影劑強度；TTP為整個造影過程中達到最大峰值強度所用時間；RT 從最大強度10%到90%的時間；MTT為從峰值下降到峰值下降的時間最大點的50%。

1.3 腫瘤組織學(xué)分級

采用Bloom Richardson標準［4］進行分級：0級，原位癌；Ⅰ級，腺管量（腺管形成占整個腫瘤比例）≥75%，核小而規(guī)則，每高倍視野核分裂（×40）≤5；Ⅱ級，腺管量10%～75%，核大但也較規(guī)則，每高倍視野核分裂象（×40）>5～10；Ⅲ級：腺管量<10%，核大而不規(guī)則，核仁明顯，每高倍視野核分裂象（×40）>10。其中Ⅰ級、Ⅱ級為高-中分化組，Ⅲ級為低分化組。

圖1 乳腺癌病灶超聲造影時間-強度曲線圖和病理、免疫組化圖Fig.1 Time-intensity curve of contrast-enhanced ultrasound and pathological and immunohistochemical diagrams of breast cancer lesions

1.4 免疫組化檢測

利用SP 法檢測ER、PR、Her-2 及Ki-67 的表達情況，判斷標準：胞核著色細胞數(shù)≥10%即判定ER、PR陽性，<10%為陰性；Her-2 過表達定義為免疫組化檢測為+++，陰性定義為-～+，部分免疫組化檢測為Her為++，此部分患者采用熒光原位雜交（FISH檢驗）檢測進一步核結(jié)果，Her-2陽性標準：Her-2（+++）或FISH陽性。Ki-67增值指數(shù)的評估：14%為臨界點。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS23.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用配對樣本t檢驗比較腫瘤組織與周邊正常組織的定量參數(shù)，采用獨立樣本t檢驗比較不同病理預(yù)后因素組的參數(shù)，應(yīng)用受試者工作特征（ROC）曲線評估超聲造影定量參數(shù)的診斷效能，AUROC>0.9認為是高診斷效能，0.7

2 結(jié)果

2.1 病理結(jié)果

腫瘤最大直徑>20 mm的病灶共76個。腫塊最大直徑≤20 mm的病灶共34個。低分化浸潤性乳腺癌28個，高-中分化浸潤性乳腺癌82個；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移74個，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36個；ER陽性69個，ER陰性41個；PR陽性57個，PR陰性53個；Her-2陽性42個，Her-2陰性68個；Ki-67陽性79個，Ki-67陰性31個。

2.2 浸潤性乳腺癌及周圍正常組織血流灌注參數(shù)

浸潤性乳腺癌邊緣帶的PI值高于周圍正常組織（P=0.000，表1），TTP值低于周圍正常組織（P=0.030），MTT值低于周圍正常組織的（P=0.001），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。浸潤性乳腺癌邊緣帶RT與正常組織相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

表1 浸潤性乳腺癌邊緣帶及周圍正常組織血流灌注參數(shù)對比Tab.1 Comparison of blood perfusion parameters in the marginal zone of invasive breast cancer and surrounding normal tissues(Mean±SD)

2.3 浸潤性乳腺癌超聲造影定量參數(shù)與預(yù)后的關(guān)系

低分化組的PI值高于高-中分化組（P=0.011），RT值長于高-中分化組（P=0.007），TTP值長于高-中分化組（P=0.018）；低分化組雖長于高-中分化組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.635）。腫瘤直徑>20 mm的浸潤性乳腺癌組的PI值高于腫瘤直徑≤20 mm組的（P=0.003），而TTP、MTT、RT相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的PI值高于非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P=0.010），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的RT值高于非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P=0.005），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義；而TTP、MTT 相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。ER陰性、PR陰性的浸潤性乳腺癌的PI值明顯高于ER陽性、PR陽性的PI值，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.014、0.031），而TTP、MTT、RT相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；有無C-erb-B2 與Ki-67 的表達患者的PI、TTP、MTT、RT相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，表2）。

2.4 不同定量超聲造影參數(shù)的診斷性能

通過ROC曲線分析，發(fā)現(xiàn)PI、RT、TTP在浸潤性乳腺癌預(yù)后因素大小、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移鑒別診斷中具有中等的診斷效能。PI在鑒別病灶大?。?20 mm）浸潤性乳腺癌時具有較高敏感度和特異性，截斷點為13.15 dB，標準誤為0.077（95%CI:0.623～0.925），敏感度和特異性分別為75.70%、82.40%，曲線下面積為0.774。PI在鑒別組織學(xué)分級（低分化）浸潤性乳腺癌，具有較高敏感度和較低特異性PI截點為13.50 dB，標準誤為0.070（95%CI:0.572～0.845），敏感度和特異性分別為81.00%、60.60%，曲線下面積為0.709。PI在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER陰性表達、PR陰性表達鑒別診斷中，PI的截斷點分別為13.500、12.975、12.975 dB，標準誤分別為0.079（95%CI:0.583～0.894）、0.073（95%CI:0.562～0.849）、0.074（95%CI:0.540～0.828），敏感度和特異性分別為69.00%、77.40%、72.20%和76.50%、65.20%、66.70%，曲線下面積分別為0.738、0.705、0.688。RT和TTP在鑒別組織學(xué)分級（低分化組）浸潤性乳腺癌時具有較高的敏感度和較低的特異性，截斷點分別為3.460 s、18.630 s，標準誤為0.074（95%CI:0.575～0.863）、0.086（95%CI:0.452～0.787），敏感度和特異性分別為71.40%、61.90%，57.60%、51.50%。此外，在鑒別淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時，RT的截斷點為3.105 s，標準誤為0.077（95%CI:0.542～0.845），敏感度較高75.90%，特異性較低58.80%，曲線下面積為0.694（表3）。

表2 浸潤性乳腺癌超聲造影定量參數(shù)與預(yù)后的關(guān)系Tab.2 Relationship between quantitative parameters of contrast-enhanced ultrasound and prognosis of invasive breast cancer(Mean±SD)

表3 不同參數(shù)對浸潤性乳腺癌病理預(yù)后因素的診斷效能Tab.3 The diagnostic efficacy of different parameters on the pathological prognostic factors of invasive breast cancer

3 討論

超聲造影是一種非侵入性評估腫瘤血管生成的方法，可以動態(tài)顯示微血管灌注情況。時間-強度曲線可直觀顯示造影劑微泡的流速、流量隨時間的變化，在一定程度上減少了超聲造影定性分析中主觀判斷造成的誤差，可客觀地反映出腫瘤內(nèi)部血管床的血流的情況［11］。其中主要參數(shù)有PI、TTP、MTT、RT。這些參數(shù)均可能與病理預(yù)后因素和分子免疫組化指標相關(guān)。

有研究指出，多數(shù)乳腺癌病灶更常表現(xiàn)出高PI、短的TTP，即呈快進高增強的超聲造影表現(xiàn)［12-13］。PI與病灶內(nèi)微血管密度相關(guān)；TTP與異常血管形成相關(guān)；MTT反映微泡的廓清速度。在本研究中，浸潤性乳腺癌的TTP和MTT比周圍正常乳腺組織短，PI比周圍正常組織高，此研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相似。分析其原因在于，與正常組織相比，腫瘤組織具有豐富的新生血管，且缺乏肌層，血管不僅走形彎曲且管壁較薄，易形成動靜脈瘺，從而促使造影劑快速進入病灶［14］。

腫瘤直徑、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是浸潤性乳腺癌傳統(tǒng)的預(yù)后因素，且組織學(xué)分級和腫瘤直徑的大小是影響患者預(yù)后的高危因素［15］。已有研究表明腫瘤直徑越大、病理分化越低、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后越差［16］。本研究顯示腫瘤直徑>20 mm的浸潤性乳腺癌組的PI高于腫瘤直徑≤20 mm組，這與冷曉玲等［17］研究一致。隨著腫瘤體積增大，在血管生成因子等因素的作用下，血管生成也相應(yīng)增加有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)低分化組的患者中呈現(xiàn)“高增強、快進延遲慢退”血流灌注模式的比例要高于高分化組的患者［18］。而本研究中發(fā)現(xiàn)低分化組PI、RT、TTP均大于高-中分化組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。表明組織分級越高的患者，血管越豐富，瘤內(nèi)血管增殖越迅速，更常見缺血壞死，導(dǎo)致腫瘤組織花更多的時間來充填造影劑死［19］。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的PI值和RT值均高于非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。這可能與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的病理組織學(xué)級別高、病灶越大有關(guān)［20］。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，以往的病理形態(tài)學(xué)診斷及分期已經(jīng)滿足不了腫瘤學(xué)研究的發(fā)展需要。而腫瘤分子生物學(xué)指標，特別是ER、PR、Ki-67、Her-2對乳腺癌預(yù)后評估及提供個體化治療具有重要意義。ER、PR表達與乳腺癌的預(yù)后及內(nèi)分泌治療的療效評估密切相關(guān)，兩者低表達的腫瘤侵襲性強，預(yù)后較差，對內(nèi)分泌治療不敏感，預(yù)后較差［21］。王婧婕等［22］研究發(fā)現(xiàn)PI與ER、PR無相關(guān)。而在本研究中發(fā)現(xiàn)ER陰性、PR陰性的浸潤性乳腺癌的PI值明顯高于ER陽性、PR陽性的PI值，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。也就是浸潤性乳腺癌ER表達陰性的比ER表達陽性的腫瘤細胞具有更高的增殖率［23］。有研究發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤的微血管密度增加，它的PI值越高，有助于證明這一事實［24］。

原癌基因Her-2與血管內(nèi)皮生長因子有一定相似性［25］。當Her-2表達增多時會發(fā)揮VEGR樣活性以促進微血管生成，使腫瘤繼續(xù)生長和轉(zhuǎn)移［26-27］。Ki-67被認為是評價腫瘤細胞增殖活性的一個重要的指標，Ki-67陽性表達提示預(yù)后不良。Du 等［28］研究發(fā)現(xiàn)TTP、MTT 的表達隨著Ki-67 的表達增強呈負相關(guān)，而到達強度隨著Ki-67的表達增強呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。徐平等［29］研究發(fā)現(xiàn)Her-2陽性和Ki-67陽性表達組的PI值較陰性組高，其TTP值短。認為Her-2、Ki-67的表達量越多，促使病變組織中產(chǎn)生了不規(guī)則的滋養(yǎng)血管和血管內(nèi)皮細胞，病變中的微血管密度越高，由于缺乏肌層，新血管形成較薄而且容易變形，易于形成動靜脈瘺，CEUS出現(xiàn)更高的PI，更短的TTP。而在本研究中，原癌基因Her-2表達陽性和Ki-67陽性表達組的PI值雖均高于原癌基因Her-2表達陰性和Ki-67表達陰性組，RT值、TTP值雖短于原癌基因Her-2表達陰性和Ki-67表達陰性，MTT值雖大于原癌基因Her-2表達陰性和Ki-67表達陰性組，但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義。分析原因，這可能與TIC分析軟件的差異、受檢者呼吸以其他原因?qū)е碌奶筋^切面移位等因素均可能導(dǎo)致結(jié)果差異，與樣本量相對較小有關(guān)，也與樣本的選擇偏移有關(guān)。

為了明確超聲造影定量分析技術(shù)評價浸潤性乳腺癌患者預(yù)后的臨床價值，本研究對有統(tǒng)計學(xué)差異的定量參數(shù)采用ROC分析。ROC曲線下面積可反映診斷試驗的預(yù)期診斷效率，取值范圍在0.5～1.0，曲線下面積越大說明診斷的真實度越高。一般認為曲線下面積為0.5～0.7時，表示診斷真實度較低，曲線下面積為0.7～0.9時，表示診斷真實度中等，曲線下面積為0.9以上時表示診斷真實度較高［30］。本研究結(jié)果顯示，PI在預(yù)測腫瘤最大徑具有中等的診斷效能，敏感性和特異性均較高，PI的截斷點為13.15 dB，曲線下面積大于0.7。PI在預(yù)測ER陰性表達、PR陰性表達鑒別診斷中具有中-低等的診斷效能，PI的截斷點均為12.975 dB，曲線下面積在0.6～0.7之間。RT在預(yù)測低分化浸潤性乳腺癌時具有具有中等的診斷效能，較高敏感性，較低特異性，截斷點分別為3.460 s，曲線下面積約0.7。這與既往研究結(jié)果相似［5］。但是這些參數(shù)的診斷效能都不夠高，它的預(yù)測能力還不可靠能夠為臨床常規(guī)使用，但可以作為復(fù)雜病變的參考方法。

另外，本研究還有一定的局限性，即PI、RT、MTT這些增強參數(shù)與部分病理預(yù)后因素兩者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但是診斷效率不夠高，出現(xiàn)這些問題的原因如下：首先，這個研究樣本量相對較小，因此隨機誤差較高，以后我們考慮一個更大的樣本來確認結(jié)果；這是一個單中心的研究，不可避免的會存在選擇偏移，以后可以通過多中心研究來克服；定量研究的興趣區(qū)域選擇是主觀的；我們只關(guān)注了乳腺癌最常見的類型，其他類型乳腺癌都沒有包括，以后還可以把其他類型乳腺癌加入研究。

綜上，PI、RT、MTT這些超聲造影增強參數(shù)可一定程度評估患者預(yù)后，這可能減少不必要的穿刺活檢和過度治療。