牡荊素對CVB3病毒性心肌炎心肌細(xì)胞損傷的影響及機制*

趙 宏，李登科，馬紅利

（1.江蘇省南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬泰康仙林鼓樓醫(yī)院超聲與功能檢查科（心功能室），南京 210000；2.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院東崗院區(qū)（中西醫(yī)結(jié)合科），蘭州 730030；3.湖北省荊州市中心醫(yī)院（心功能室），荊州 434020）

病毒性心肌炎是由病毒感染引起的心肌急性或慢性炎癥病變，以心肌細(xì)胞壞死、凋亡、間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤為主要改變[1-2]。目前，病毒性心肌炎無特異性治療方法，多以針對病毒感染和心肌炎癥治療為主，近年來多項研究表明，中醫(yī)藥在病毒性心肌炎的治療中取得了顯著的療效[3-4]。病毒性心肌炎的致病病毒為柯薩奇B 組（CVB）病毒，其中CVB3具有強嗜心性，因此目前多利用CVB3 感染心肌細(xì)胞構(gòu)建病毒性心肌炎細(xì)胞模型[5]。本研究選擇人心肌細(xì)胞株AC-16為研究對象，建立病毒性心肌炎細(xì)胞模型，研究牡荊素對CVB3 感染的心肌細(xì)胞凋亡和炎癥的影響及其潛在作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人心肌細(xì)胞AC-16 購自美國ATCC；牡荊素購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司；CVB3 病毒株由上海中山醫(yī)院病毒性心肌炎實驗室提供；DMEM/F12 培養(yǎng)基購自北京索萊寶生物科技有限公司；MTT 試劑購自美國Sigma 公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海貝博生物科技有限公司；實驗用抗體均購自上海生工生物工程有限公司；人白細(xì)胞介素1β（IL-1β）ELISA試劑盒和腫瘤壞死因子（TNF-α）ELISA試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 AC-16細(xì)胞培養(yǎng)

將AC-16 細(xì)胞加入含10 %胎牛血清和1%青霉素和鏈霉素混合液的DMEM/F12完全培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至60%～70%融合時，加入胰酶消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的AC-16 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3 實驗方法

1.3.1 CVB3病毒性心肌炎心肌細(xì)胞模型建立將對數(shù)生長期的AC-16細(xì)胞，進(jìn)行消化、計數(shù)，制成2×106個/mL 的單細(xì)胞懸液，接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔100μL；將細(xì)胞分為5組：正常組、病毒組、牡荊素低劑量組（10 mg/kg）、牡荊素中劑量組（30 mg/kg）和牡荊素高劑量組（50 mg/kg），置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，然后分別在病毒組和牡荊素各劑量組加入含103TCID50毒力的CVB3病毒的DMEM/F12培養(yǎng)液，孵育2 h后，正常組和病毒組分別加入含2%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)液，牡荊素低、中、高劑量組分別加入等量含2%胎牛血清及終濃度分別為10 mg/kg、30 mg/kg、50 mg/kg的牡荊素的DMEM/F12 培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，構(gòu)建病毒性心肌炎細(xì)胞模型。

1.3.2 MTT 法檢測各組細(xì)胞增殖活性 將“1.3.1”項中各組細(xì)胞培養(yǎng)孔中培養(yǎng)液吸除，分別加入90μL新鮮的完全培養(yǎng)液和10μL的MTT溶液，培養(yǎng)4 h；棄上清，每孔加入100μL 二甲基亞砜，輕輕震蕩培養(yǎng)10 min。酶標(biāo)儀上檢測每孔490 nm 處吸光度值（OD值）。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡取“1.3.1”中各組細(xì)胞，加入胰酶消化后，離心收集細(xì)胞，使用預(yù)冷的PBS 溶液沖洗細(xì)胞。參考Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明，重懸細(xì)胞，然后分別加入5μLAnnexin V-FITC和5μLPI，室溫避光染色15 min。流式細(xì)胞儀上機檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.3.4 Western blotting 實驗檢測Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá) 離心收集各組細(xì)胞，使用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。取適量蛋白樣品放入沸水浴中加熱3～5 min，使蛋白充分變性，然后進(jìn)行SDS-PAGE 分離目的蛋白；轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜（NC膜），加入5%脫脂奶粉封膜2 h；PBS洗膜，加入稀釋后的Bcl-2(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、β-actin一抗（1∶10 000），4 ℃冰箱孵育過夜，洗膜，然后加入稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗(1∶1 000)，搖床上緩慢搖動孵育1 h；洗膜，加入ECL 發(fā)光液染色，顯微鏡下曝光、拍照。

1.3.5 ELISA 法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β 和TNF-α的表達(dá) 離心收集各組細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，參照IL-1β和TNF-α ELISA試劑盒說明書，檢測培養(yǎng)上清液中IL-1β和TNF-α的水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所有實驗均進(jìn)行3 次重復(fù)，采用SPSS19.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 牡荊素對CVB3感染心肌細(xì)胞增殖的影響

與正常組比較，病毒組心肌細(xì)胞增殖活力明顯降低（P＜0.05）；與病毒組比較，牡荊素低、中、高劑量組心肌細(xì)胞增殖活力均明顯升高（P＜0.05），其中牡荊素中、高劑量組心肌細(xì)胞增殖活力明顯高于牡荊素低劑量組（P＜0.05），而牡荊素中、高劑量組心肌細(xì)胞增殖活力比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。說明牡荊素能夠促進(jìn)CVB3 感染心肌細(xì)胞的增殖能力。

表1 MTT法檢測各組細(xì)胞OD值

表1 MTT法檢測各組細(xì)胞OD值

與正常組比較，aP＜0.05；與病毒組比較，bP＜0.05；與牡荊素低劑量組比較，CP＜0.05。

2.2 牡荊素對CVB3感染心肌細(xì)胞凋亡的影響

與正常組比較，病毒組心肌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）；與病毒組比較，牡荊素低、中、高劑量組心肌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率均降低，并呈劑量依賴性（P＜0.05），見圖1 和表2。說明牡荊素能夠抑制CVB3誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。

2.3 牡荊素對CVB3 感染心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

與正常組比較，病毒組心肌細(xì)胞中Bcl-2 蛋白相對表達(dá)水平降低，Bax 蛋白相對表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與病毒組比較，牡荊素低、中、高劑量組心肌細(xì)胞中Bcl-2蛋白相對表達(dá)水平均升高，Bax蛋白相對表達(dá)水平均降低（P＜0.05）；其中牡荊素中、高劑量組心肌細(xì)胞中Bcl-2蛋白相對表達(dá)水平明顯高于牡荊素低劑量組，Bax 蛋白相對表達(dá)水平明顯低于牡荊素低劑量組（P＜0.05），而牡荊素高劑量組心肌細(xì)胞中Bax蛋白相對表達(dá)量明顯低于牡荊素中劑量組（P＜0.05），見圖2和表3。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

表2 各組細(xì)胞凋亡率比較%，

表2 各組細(xì)胞凋亡率比較%，

與正常組比較，aP＜0.05；與病毒組比較，bP＜0.05；與牡荊素低劑量組比較，cP＜0.05；與牡荊素中劑量組比較，dP＜0.05。

2.4 牡荊素對CVB3感染心肌細(xì)胞炎癥的影響

與正常組比較，病毒組心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β 和TNF-α 水平均升高（P＜0.05）；與病毒組比較，牡荊素低、中、高劑量組心肌細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β 和TNF-α 水平均降低（P＜0.05），其中牡荊素中、高劑量組心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β 和TNF-α水平明顯低于牡荊素低劑量組（P＜0.05），牡荊素高劑量組心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β和TNFα 水平明顯低于牡荊素中劑量組（P＜0.05），見表4。說明牡荊素能夠減輕CVB3 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

圖2 Western blotting檢測Bcl-2、Bax蛋白的相對表達(dá)量

表3 各組細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白相對表達(dá)水平比較

表3 各組細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白相對表達(dá)水平比較

與正常組比較，aP＜0.05；與病毒組比較，bP＜0.05；與牡荊素低劑量組比較，cP＜0.05；與牡荊素中劑量組比較，dP＜0.05。

表4 各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β和TNF-α水平比較

表4 各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β和TNF-α水平比較

與正常組比較，aP＜0.05；與病毒組比較，bP＜0.05；與牡荊素低劑量組比較，CP＜0.05；與牡荊素中劑量組比較，dP＜0.05。

2.5 牡荊素對CVB3感染心肌細(xì)胞中p38 MAPK通路的影響

與正常組比較，病毒組心肌細(xì)胞中p-p38 MAPK/p38 MAPK 蛋白相對表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與病毒組比較，牡荊素低、中、高劑量組心肌細(xì)胞中p-p38 MAPK/p38 MAPK蛋白相對表達(dá)水平均降低，并呈劑量依賴性（P＜0.05），見圖3 和表5。說明牡荊素能夠抑制CVB3 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中p38 MAPK信號通路激活。

圖3 Western blotting 檢測p38 MAPK、p-p38 MAPK 蛋白的相對表達(dá)量

表5 各組p-p38 MAPK/p38 MAPK蛋白相對表達(dá)水平比較

表5 各組p-p38 MAPK/p38 MAPK蛋白相對表達(dá)水平比較

與正常組比較，aP＜0.05；與病毒組比較，bP＜0.05；與牡荊素低劑量組比較，cP＜0.05；與牡荊素中劑量組比較，dP＜0.05。

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為病毒性心肌炎屬“溫?zé)帷?、“心悸”等范疇，多認(rèn)為素體正氣不足，溫?zé)岫拘扒忠u肺、心，導(dǎo)致心之氣血失調(diào)，兼見淤血、濕阻、痰濁等多種病理產(chǎn)物停積，是其主要病因[6-7]。牡荊素是一類從牡荊葉和牡荊子中提取的黃酮類化合物，其主要功效是活血化瘀、理氣通脈，具有抗心肌缺血再灌注損傷、抗缺血性神經(jīng)損傷及抗腫瘤等多種功能[8-10]。已有研究表明，牡荊素對CVB3 誘導(dǎo)的病毒性心肌炎大鼠心肌損傷具有保護作用[11]。但目前牡荊素保護病毒性心肌細(xì)胞損傷的作用及機制尚不完全清楚。

本研究利用CVB3體外誘導(dǎo)構(gòu)建人病毒性心肌炎細(xì)胞模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)牡荊素能夠有效改善CVB3誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖活性降低，促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖（P＜0.05）；流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，CVB3 誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡明顯增加，而牡荊素能夠有效抑制心肌細(xì)胞凋亡（P＜0.05）。Bcl-2和Bax是細(xì)胞凋亡相關(guān)基因，Bcl-2 是細(xì)胞凋亡抑制基因，Bax 不能拮抗Bcl-2的抑制凋亡作用，而且具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的功能[12]。本研究Western blotting 實驗結(jié)果也表明，CVB3誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中促凋亡作用的Bax基因表達(dá)增加，而Bcl-2基因表達(dá)減少，牡荊素則能逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象（P＜0.05）。說明牡荊素能夠促進(jìn)CVB3 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖，并抑制心肌細(xì)胞凋亡，對CVB3誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷具有保護作用。

炎癥反應(yīng)是病毒性心肌炎的主要病癥之一，在病毒性心肌炎發(fā)生及后續(xù)心肌重構(gòu)、心律失常、心力衰竭等病理變化中具有重要作用[13]。因此，抑制心肌炎癥反應(yīng)是保護心肌損傷，減緩或阻止病毒性心肌炎進(jìn)展的重要措施。IL-1β 和TNF-α 是炎癥反應(yīng)中主要的炎性細(xì)胞因子，韋迎娜等[14]研究表明，槲皮素可減弱CVB3誘導(dǎo)的乳鼠心肌組織和心肌細(xì)胞中IL-1β、TNF-α水平，減輕炎癥反應(yīng)，提高小鼠存活率。楊怡俠等[15]研究表明，黃芪三萜皂苷可抑制CVB3誘導(dǎo)的小鼠心肌組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平增加，減少小鼠心肌損傷面積，提高小鼠存活率。本研究結(jié)果顯示，CVB3誘導(dǎo)人心肌細(xì)胞中IL-1β 和TNF-α 水平升高，而牡荊素能夠抑制CVB3 誘導(dǎo)的IL-1β和TNF-α水平升高（P＜0.05）。說明牡荊素能夠抑制CVB3誘導(dǎo)的人心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

p38 MAPK 信號通路是MAPK 家族成員，在一些環(huán)境壓力和炎癥細(xì)胞因子刺激下可被激活，參與多種生理和病理反應(yīng)過程。研究表明，在病毒性心肌炎早期存在p38 MAPK 信號通路活化，可能參與其病理過程[16-17]。本研究結(jié)果顯示，CVB3能夠誘導(dǎo)人心肌細(xì)胞中p-p38 MAPK 表達(dá)增加，而牡荊素對p-p38 MAPK 具有明顯的抑制作用（P＜0.05），提示牡荊素對CVB3誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的保護作用可能與抑制p38 MAPK通路活化有關(guān)。

綜上所述，牡荊素對CVB3 誘導(dǎo)的人心肌細(xì)胞的損傷具有保護作用，其作用機制可能與抑制p38 MAPK通路活性有關(guān)，為牡荊素在病毒性心肌炎臨床治療中的應(yīng)用提供了實驗參考。