甲苯磺酸索拉非尼片微生物限度檢查方法研究

張春華，劉緒平，鄧維，章瑛

江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價重點實驗室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術研究中心，江西 南昌 330029

甲苯磺酸索拉非尼片，商品名為多吉美（Nexavar）為多靶點抗腫瘤藥，臨床上主要用于不能手術的晚期腎細胞癌以及無法手術或遠處轉(zhuǎn)移的肝細胞癌。其對原發(fā)性肝癌治療效果好，可延遲病灶進展、改善生存質(zhì)量和健康水平，且降低不良影響的發(fā)生率［2-6］。最常見的不良反應為胃腸道反應和血小板降低及手足皮膚反應［7-10］，為預防患者用藥時帶來一些安全隱患，本研究根據(jù)《中國藥典》2015 年版四部的要求對其進行了微生物限度計數(shù)方法研究，建立了甲苯磺酸索拉非尼片的微生物限度檢查方法［1］，且檢驗效果良好。

1 實驗儀器與材料

1.1 實驗儀器

電子天平Quintix6101-1CN；生物安全柜13844'BSC賽默飛；細菌培養(yǎng)箱SPL-250；霉菌培養(yǎng)箱3758CN；集菌儀；恒溫震蕩器。

1.2 培養(yǎng)基

所用培養(yǎng)基適用性均符合《中國藥典》2015 年版四部的要求，見表1。

表1 培養(yǎng)基信息

1.3 試驗菌種

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC（B）26003，銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），CMCC（B）10104；大腸埃希菌（Escherichia coli），CMCC（B）44102；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），CMCC（B）63501；黑曲霉（Aspergillus niger），CMCC（F）98003；白色念珠菌（Candida albicans），CMCC（F）98001。菌種均來源于中國食品藥品檢定研究院。

1.4 樣品

甲苯磺酸索拉非尼片，江西山香藥業(yè)有限公司，規(guī)格：0.2 g，批號：180501。

2 方法

2.1 菌液的制備

取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌分別接種于適量的TSB 中，經(jīng)33 ℃培養(yǎng)24 h 后，取新鮮培養(yǎng)物1 mL，用pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液10 倍稀釋至10-3～10-7。

取黑曲霉接種至SDA 斜面上，經(jīng)23 ℃培養(yǎng)1周后，取新鮮培養(yǎng)物用3 mL～5 mL 含0.05%吐溫80 的0.9%無菌氧化鈉溶液洗下黑曲霉孢子，吸取出孢子懸液1 mL，加上述稀釋劑適量稀釋，用標準比濁管比濁，其濁度與標準比濁管相當后，取1 mL 稀釋后的孢子懸液，用上述稀釋劑10 倍稀釋至10-2～10-4。

取白色念珠菌接種于適量的SDA 中，經(jīng)23 ℃培養(yǎng)3 d 后，取新鮮培養(yǎng)物1 mL，用pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液10 倍稀釋至10-2～10-4。

上述試驗菌株均為第2 代菌。

2.2 樣品的制備

取本品10 g，放置無菌的錐形瓶中，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，恒溫振搖5 min，作為1∶10 供試液。

2.3 方法驗證

2.3.1 預實驗選用金黃色葡萄球菌（需氧菌）、白色念珠菌（真菌）作為敏感菌株進行預試驗，結果詳見表2 和表3。

表2 金黃色葡萄球菌預試驗的結果

表3 白色念珠菌預試驗的結果

上述結果表明，甲苯磺酸索拉非尼片對需氧菌具有抑制作用，而對霉菌和酵母菌沒有抑制作用，根據(jù)預試驗的結果，初步確定采用薄膜過濾法（1∶10的供試液1 mL，沖洗300 mL）進行需氧菌總數(shù)計數(shù)，采用平皿法（1∶10 的供試液）進行霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)。

2.3.2 微生物計數(shù)方法的適用性試驗適量的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液抽入濾器中，然后取上述制備好的1∶10 供試液1 mL，混勻，全部通過濾膜，再用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液300 mL沖洗，每次100 mL/筒，沖洗3 次，在最后一次沖洗液中加入試驗菌（≤100 cfu），濾干，立即貼膜于預制好的TSA 平板上，作為需氧菌總數(shù)計數(shù)法檢查。

取6 支試管，4 支試管分別加入上述制備好的1∶10 供試液9.9 mL 和2 支試管加入pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液9.9 mL，再加入適宜濃度的試驗菌液0.1 mL，混勻，作為試驗組和菌液對照組。分別取注入平皿，測定霉菌和酵母菌總數(shù)。

取上述制備好的1∶10 供試液和相應稀釋液替代供試液同試驗組操作，測定供試品對照組菌落數(shù)和菌液組菌落數(shù)。

需氧菌總數(shù)選用金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌（置33 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h～72 h）白色念珠菌和黑曲霉（置33 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h～120 h），霉菌和酵母菌總數(shù)選用白色念珠菌和黑曲霉（置23 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h～120 h），均需逐日觀察結果。結果均符合要求，見表4。

表4 微生物計數(shù)方法適用性試驗結果

回收比值=（供試品試驗組菌落數(shù)－供試品對照組菌落數(shù)）÷菌液組菌落數(shù)

2.3.3 控制菌檢查方法適用性試驗 取上述制備好的1∶10 供試液10 mL 加入100 mL TSB 中，同時加入小于100 cfu 的大腸埃希菌液，混勻后，培養(yǎng)18 h 后，取培養(yǎng)物1 mL 接種至100 mL MACB 中，置42 ℃培養(yǎng)24 h 后，取MACB 增菌液劃線接種于MACA平板上，置33 ℃培養(yǎng)72 h 后，取MACA 平板上菌落經(jīng)純化后的培養(yǎng)物，接種至含5 mL MUG 培養(yǎng)基的試管內(nèi)，同時用未接種的MUG 培養(yǎng)基作本底對照。置33 ℃培養(yǎng)，于5 h、24 h 在366 nm 紫外線下觀察，取稀釋液10 mL 照上述方法操作，作為陰性對照組。

試驗組的 MUG-I 呈現(xiàn)藍白色熒光，觀察后，沿管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，試驗組的MUG-I 液面呈玫瑰紅色，試驗呈陽性，檢出大腸埃希菌；陰性對照組的 MUG-I 未呈熒光，試驗呈陰性，未檢出大腸埃希菌。

3 討論

在進行供試品計數(shù)方法驗證時，根據(jù)樣品的成分和性質(zhì)判斷，選擇對供試品可能敏感的菌株進行試驗，從預實驗的結果建立樣品的微生物計數(shù)方法。綜合上述研究結果顯示，甲苯磺酸索拉非尼片具有一定的抑菌作用，尤其是對于細菌抑菌性較強，若采取平皿法，會導致試驗結果的回收效果不理想。為了研究微生物限度檢查方法的成效，按照藥典要求對甲苯磺酸索拉非尼片微生物限度檢查進行研究，所實驗的各試驗菌其回收比值符合藥典規(guī)定，試驗方法可用于甲苯磺酸索拉非尼片的微生物限度檢查。