檢測VKORC1、CYP2C9*3基因多態(tài)性指導(dǎo)急性肺血栓栓塞癥患者華法林抗凝治療的價值*

鄧文 周燕虹 劉丹 李為民 陳勃江

(四川大學(xué)華西醫(yī)院 1.呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科;2.實驗醫(yī)學(xué)科，四川 成都 610041)

急性肺血栓栓塞癥(Pulmonary thromboembolism, PTE)是臨床常見危急重癥[1]，抗凝是非高危急性PTE治療的基石[2]，其中華法林是最常用的抗凝藥物。華法林具有效果確切、價格低廉等優(yōu)勢,但因與多種藥物或食物存在相互作用，且不同個體表現(xiàn)出不同代謝速度，劑量差異大，需定期監(jiān)測凝血功能，尤其是國際標(biāo)準(zhǔn)化比值(International normalized ratio,INR)[3]。華法林的主要靶點是維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合物1(Vitamin K epoxide reductase complex 1, VKORC1)[4]。野生型VKORC1基因為AA型，突變型則包括GA 型和GG 型兩種類型。VKORC1基因多態(tài)性是影響華法林使用劑量的重要因素，且亞洲人群中VKORC1的突變比例高[5]。因此，臨床中有患者在接受華法林使用前進(jìn)行VKORC1基因多態(tài)性檢測。華法林主要通過肝臟代謝，細(xì)胞色素P450酶2C9(Cytochrome P450 2C9,CYP2C9)基因所編碼的蛋白是介導(dǎo)其代謝的關(guān)鍵因子[6]。CYP2C9有多個突變位點，其中CYP2C9*3是最重要的亞型之一[7]。國家衛(wèi)生計生委發(fā)布的《藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術(shù)指南》明確指出：臨床應(yīng)根據(jù)VKORC1和CYP2C9*3基因型為患者制定華法林抗凝治療方案，減少調(diào)整次數(shù)并快速達(dá)到目標(biāo)劑量[8]；但2018年發(fā)布的《肺血栓栓塞癥診治與預(yù)防指南》[9]不推薦常規(guī)進(jìn)行藥物基因組檢測指導(dǎo)華法林的劑量選擇和調(diào)節(jié)。為探索臨床實踐中VKORC1、CYP2C9*3基因多態(tài)性檢測的意義，本研究回顧性分析VKORC1、CYP2C9*3基因多態(tài)性檢測在急性PTE患者接受華法林治療中的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性收集2016年1月～2018年12月于四川大學(xué)華西醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科住院接受華法林抗凝治療的411例成人PTE患者，其中119例自愿接受VKORC1和CYP2C9*3基因多態(tài)性檢測，并根據(jù)檢測結(jié)果確定華法林劑量為指導(dǎo)組；292例未接受VKORC1和CYP2C9*3檢測，醫(yī)生按臨床經(jīng)驗使用、監(jiān)測和調(diào)整華法林為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①按照2018年《肺血栓栓塞癥診治與預(yù)防指南》[9]標(biāo)準(zhǔn)，確診為急性PTE，且為非高危組。②接受華法林抗凝并達(dá)到穩(wěn)定維持劑量。③臨床、隨訪資料齊全。④年齡≥18歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①同時使用維生素K、阿司匹林、胺碘酮、磺胺、甲硝唑、克拉霉素、環(huán)丙沙星、氟康唑、奧美拉唑、雌激素、利福平等可能影響華法林代謝的藥物。②合并有嚴(yán)重血常規(guī)、肝腎功能等重要臟器功能不全。③雖診斷急性PTE，但因活動性咯血、消化道出血、凝血功能異常等原因不能接受華法林治療者。④妊娠或哺乳期婦女?；陔娮硬v系統(tǒng)收集兩組患者的性別、年齡、民族、吸煙、基礎(chǔ)疾病、華法林維持劑量信息；查閱指導(dǎo)組的VKORC1和CYP2C9*3基因多態(tài)性檢測結(jié)果。所有病例通過電話隨訪，詢問使用華法林后6個月內(nèi)的死亡、大出血、新發(fā)血栓事件。相關(guān)定義：國際標(biāo)準(zhǔn)化比值(INR)達(dá)標(biāo)：以INR 2-3視為達(dá)標(biāo)。大出血：需要停止華法林使用的全身出血，一般INR≥4。新發(fā)血栓：除診斷PTE時所發(fā)現(xiàn)的血栓之外的血栓。指導(dǎo)組患者均知情同意行基因多態(tài)性檢測。本研究經(jīng)過四川大學(xué)華西醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 基因多態(tài)性檢測 在使用華法林前，抽取清晨空腹外周靜脈血4 mL，于EDTA抗凝管保存，立即送實驗醫(yī)學(xué)科檢測。首先加入紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，獲得白細(xì)胞；再利用全血基因組提取試劑盒提取全血DNA，于-20 ℃保存，采用“人類 VKORC1 和 CYP2C9*3基因多態(tài)性檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)進(jìn)行基因多態(tài)性檢測；e-Hyb全自動雜交儀(BR-526-24)雜交顯色；生物芯片識讀儀(BE2.0)識別讀數(shù)[10]。

1.3 華法林初始劑量及調(diào)整 指導(dǎo)組第1～3 d的華法林初始劑量登陸網(wǎng)站www.WarfarinDosing.org進(jìn)行計算，需納入CYP2C9*3和VKORCI 基因型及其他相關(guān)臨床資料參數(shù)。對照組第1～3 d則由臨床醫(yī)師根據(jù)經(jīng)驗給藥，通常為每天2.5 mg。用藥第4 d查INR，并據(jù)此調(diào)整劑量。達(dá)到目標(biāo)INR值(2-3)前，每3 d監(jiān)測和調(diào)整一次，直至達(dá)標(biāo)。

1.4 觀察指標(biāo) 主要指標(biāo)：從開始使用華法林到INR第一次達(dá)標(biāo)(2-3)的時間(d)。次要指標(biāo)：穩(wěn)定時(INR 2-3)的華法林維持劑量(mg)。隨訪兩組患者自接受華法林抗凝開始到第6個月末時的不良反應(yīng)，包括死亡、大出血、新發(fā)血栓。

2 結(jié)果

2.1 兩組基本資料比較 兩組患者在性別、年齡、吸煙史、基礎(chǔ)疾病等方面均無顯著性差異(均P>0.05)。見表1。

表1 兩組患者基本資料比較[n(×10-2)]

2.2 主要與次要終點

2.2.1 主要終點 本研究的主要終點為從診斷PTE到INR第一次達(dá)標(biāo)(2-3)的時間，指導(dǎo)組較對照組未顯示出統(tǒng)計學(xué)優(yōu)勢(P=0.494)。對指導(dǎo)組進(jìn)一步進(jìn)行亞組分析，VKORC1和CYP2C9*3均以AA野生型多見；兩個位點均突變5例，占4.20%。從指導(dǎo)組達(dá)到INR目標(biāo)值的時間看，不同VKORC1和CYP2C9*3基因型組合的INR達(dá)標(biāo)時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.382)。見表2。

表2 從開始使用華法林到INR第一次達(dá)標(biāo)(2- 3)的時間

2.2.2 次要終點 本研究的次要終點為穩(wěn)定時華法林的維持劑量。指導(dǎo)組與對照組無顯著性差異(P=0.317)。不同VKORC1和CYP2C9*3基因型組合的劑量也相似，未顯示出統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.177)。見表3。

表3 穩(wěn)定時華法林的維持劑量

2.3 不良事件 在隨訪過程中，指導(dǎo)組有2例死亡(1.68%)，均為惡性腫瘤患者，死于非華法林相關(guān)的全身多器官功能衰竭，且為VKORC1 AA型合并CYP2C9*3 AA型(野生型)；對照組有9例死亡(3.08%)，其中6例因惡性腫瘤全身廣泛轉(zhuǎn)移死亡，2例因腦卒中合并肺部嚴(yán)重感染死亡，1例慢性心功能不全死亡，也與華法林無直接關(guān)系。

指導(dǎo)組有6例(5.04%)出現(xiàn)大出血需要停用華法林，其中3例為肺癌合并明顯咯血(均為VKORC1 AA型合并CYP2C9*3 AA型，野生型)，3例分別為肝癌、乳腺癌、腎病綜合征，新發(fā)黑便考慮消化道出血(2例為VKORC1AA型合并CYP2C9*3 AA型，1例VKORC1 AA型合并CYP2C9*3AC型)。6例在出血時查INR4.29～6.08，予停用華法林及維生素K拮抗，出血停止，INR下降至3以下，后期予低分子肝素抗凝。對照組12例(4.11%)出現(xiàn)大出血停用華法林，其中6例肺癌抗凝治療過程中咯血停華法林；4例為心功能不全；2例為骨折圍手術(shù)期手術(shù)部位滲血明顯。對照組12例出血病人的INR波動在4.16～5.92，均停華法林和維生素K拮抗，骨折患者術(shù)后1周再次啟動普通肝素抗凝，其余患者改低分子肝素抗凝。

在INR達(dá)標(biāo)后、華法林維持治療期間，指導(dǎo)組有5例(4.20%)出現(xiàn)新發(fā)下肢深靜脈血栓，其中1例為結(jié)締組織疾病且VKORC1 GA型合并CYP2C9*3 AA型、2例為VKORC1 AA型合并CYP2C9*3 AA型(分別有淋巴瘤和慢性腎功能不全基礎(chǔ)疾病)、2例為VKORC1 AA型合并CYP2C9*3 AC型(均為結(jié)締組織疾病患者)。對照組有10例(3.42%)出現(xiàn)新發(fā)血栓，其中4例因惡性腫瘤行鎖骨下中心靜脈置管出現(xiàn)導(dǎo)管相關(guān)血栓，6例慢性心功能不全出現(xiàn)下肢深靜脈血管。

上述不良事件發(fā)生率，兩組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，見表4。

表4 兩組不良事件發(fā)生率比較[ n(×10-2)]

3 討論

本研究為回顧性觀察性研究，以確診急性PTE且接受華法林抗凝治療的患者為研究對象，其中基因檢測指導(dǎo)組為指導(dǎo)組，常規(guī)治療組為對照組。以INR 2-3為達(dá)標(biāo)，主要研究終點為從開始使用華法林到INR第一次達(dá)標(biāo)的時間，次要研究終點為穩(wěn)定時華法林的維持劑量，評估檢測VKORC1、CYP2C9*3基因多態(tài)性檢測指導(dǎo)急性PTE患者華法林抗凝治療的作用，探討藥物基因組檢測的臨床可行性。結(jié)果顯示，兩組的主要終點和次要終點均無顯著性差異，提示華法林基因檢測在急性PTE抗凝治療中的意義有限。但本研究為單中心、單病種的回顧性分析，可能還需要多中心、隨機(jī)對照、前瞻性干預(yù)實驗來進(jìn)一步驗證。

華法林是非高危急性PTE抗凝治療的主要藥物，在新型口服抗凝藥問世前為一線用藥。但因代謝個體差異明顯、受食物及其它藥物影響大、治療濃度范圍窄，在達(dá)到穩(wěn)定抗凝效果前，需要密切監(jiān)測和調(diào)整?；蜻z傳多態(tài)性是影響華法林給藥劑量的重要因素，VKORC1和CYP2C9所編碼的蛋白分別介導(dǎo)華法林與靶點的相互作用及華法林代謝而成為近年研究熱點。VKORC1的1639 G/A位于啟動子區(qū)，調(diào)控VKORC1的表達(dá)[11]。既往研究顯示，不同種族人群中VKORC1-1639 A/G 基因多態(tài)性各異[12]。本研究顯示，在119例基因檢測組中，AA型VKORC1為89例，占74.79%，與YAN等[13]報道結(jié)果基本一致。在突變型(n=30)中，GA型29例，僅1例為GG型，也符合既往研究的趨勢[14]。VKORC1蛋白是影響維生素K代謝的關(guān)鍵限速酶，一般認(rèn)為，VKORC1突變型個體華法林代謝快，所需要的華法林劑量高于野生型[15]。本研究中，GA型VKORC1患者達(dá)到目標(biāo)INR時穩(wěn)定華法林劑量的平均值分別為5.72 mg(合并CYP2C9*3 AA型)、6.88 mg(合并CYP2C9*3 AC型)，似乎高于VKORC1 AA型(5.42 mg、5.16 mg)，與其它研究趨勢一致，但并未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)差異。導(dǎo)致這種結(jié)果的原因可能與樣本量相對較小有關(guān)，尤其是突變組，僅30例(GA型29例，GG型1例)。

CYP2C9有CYP2C9*1、CYP2C9*2和CYP2C9*3三種突變類型，其中CYP2C9*1為野生型，而CYP2C9*2尚無在中國人群中檢出的報道。為此，現(xiàn)有針對中國人群CYP2C9基因多態(tài)性的研究多集中于CYP2C9*3。1075A→C是CYP2C9*3的突變主要類型，使華法林的代謝減慢，患者所需的華法林維持劑量減少[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，CYP2C9*3野生型(AA)106例，占89.08%；僅13例(10.92%)發(fā)生突變，為AC型，突變頻率與之前的報道吻合[17]。在CYP2C9*3突變、但VKORC1未發(fā)生突變組，患者達(dá)到目標(biāo)INR的華法林維持劑量為(5.16±0.55) mg，較CYP2C9*3野生型組確有所降低，但未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)差異。王森等[18]近期發(fā)表的關(guān)于高齡非瓣膜性房顫患者接受華法林治療的研究，也得出了類似結(jié)果，CYP2C9突變組的華法林理論劑量低于野生型組，但實際用量并無差異。

如上所述，VKORC1突變，所需要的華法林劑量增高；而CYP2C9*3突變則使華法林的維持劑量降低。可見，在復(fù)雜的人體中，華法林代謝受到錯綜復(fù)雜的影響。有學(xué)者納入多變量進(jìn)行多元線性回歸分析，發(fā)現(xiàn)CYP2C9在模型中的系數(shù)最高，為0.230；而VKORC1次之，為0.159，提示CYP2C9的基因多態(tài)性可解釋23.0%的華法林劑量差異，VKORC1則解釋15.9%的差異[18]。此外，性別、年齡、身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)肝腎功、吸煙、飲酒、飲食、聯(lián)合用藥等也是影響華法林代謝不可忽視的因素。本研究為陰性結(jié)果，未獲得VKORC1、CYP2C9*3基因多態(tài)性與華法林用藥之間的顯著相關(guān)性，或許正是因為影響華法林的因素眾多，基因多態(tài)性變異在本研究人群中未表現(xiàn)出明顯作用。

4 結(jié)論與啟示

VKORC1、CYP2C9*3基因多態(tài)性檢測在指導(dǎo)急性PTE患者接受華法林抗凝治療中的意義有限，與《肺血栓栓塞癥診治與預(yù)防指南》的推薦吻合，也與Kimmel SE等在美國所開展的多中心臨床研究類似；但和其他眾多陽性結(jié)果報道矛盾[6,16,17,19]，也與國家衛(wèi)生計生委所發(fā)布指南不一致。但本研究樣本量相對較小、僅為四川大學(xué)華西醫(yī)院單中心、急性PTE單一病種，代表性有限。若能聯(lián)合全國不同地域、不同級別醫(yī)療中心開展大樣本、多中心、前瞻性對照研究，可能有望得出更有說服力的結(jié)果。