EVI1表達(dá)與食管癌細(xì)胞放療敏感性的關(guān)系及機(jī)制*

邊超 姜海燕 張慧敏 李智軍

(內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院 1.放射治療科；2.畢業(yè)后醫(yī)學(xué)教育辦公室，內(nèi)蒙古 呼和浩特010017)

食管癌在我國惡性腫瘤中發(fā)病率排名第三，死亡率排名第四，嚴(yán)重威脅患者的生命健康[1]。目前手術(shù)與放化療相結(jié)合的綜合治療是食管癌患者的主要治療策略，雖然隨著醫(yī)療技術(shù)的提高，治療策略取得了顯著的進(jìn)展，但是食管癌患者的預(yù)后仍然不盡人意，其5年生存率仍較低[2]。研究報道放療抵抗是食管癌患者預(yù)后不良的主要原因[3]。因此研究食管癌放療抵抗的分子機(jī)制，增加腫瘤對放療的敏感性是改善患者臨床癥狀的重要策略。異位病毒整合位點1(ecotropic viral integration siECA109, EVI1)是一個雙域鋅指轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞更新和骨髓祖細(xì)胞分化中起著重要作用，其異常表達(dá)可導(dǎo)致骨髓增生異常綜合征和急性髓細(xì)胞性白血病等造血源性惡性腫瘤[4-6]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)EVI1與實體瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和卵巢癌等惡性腫瘤[7-9]。研究報道EVI1與腫瘤治療抵抗相關(guān)，在鼻咽癌中EVI1的表達(dá)上調(diào)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的放化療抵抗[10]，但EVI1在食管癌中的相關(guān)研究鮮有報道，因此本文對此進(jìn)行了相關(guān)研究，旨在獲得EVI1作為增加食管癌細(xì)胞放射敏感性的潛在分子靶點。

1 材料與方法

1.1 主要試劑材料 Trizol試劑購自美國Sigma公司，ULtraRT one step RT-PCR Kit試劑盒購自北京百奧萊博生物技術(shù)有限公司，EVI1和GAPDH引物購自上海生工生物工程有限公司，胎牛血清、基礎(chǔ)培養(yǎng)基和胰蛋白酶購自美國Gibco公司，食管癌細(xì)胞系ECA109購自美國ATCC細(xì)胞庫，RIPA裂解液和BCA檢測蛋白濃度試劑盒購自美國Thermo公司，PVDF膜和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國millipore公司，EVI1 siRNA購自中國上海吉凱基因試劑有限公司，MTS試劑購自美國GlpBio公司，吉姆薩染液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物技術(shù)有限公司，EVI1抗體、活化caspase 3、Bcl-2和Bax抗體購自英國Abcam公司。

1.2 臨床樣本 選擇2017年1月～2019年2月在我院診治的食管癌患者，納入中晚期不適合手術(shù)治療而進(jìn)行放射治療的初次治療的食管癌病例67例，其中男性患者38例，女性患者29例；年齡≤55歲21例，>55歲46例；放療敏感型患者42例，放療抵抗型患者25例；中高分化35例，低分化32例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例；Ⅲ期31例，Ⅳ期36例。患者放療方案以2 Gy/f為參考劑量，總劑量為50～60 Gy/20～30 f，并根據(jù)CT掃描結(jié)果進(jìn)行療效評定。納入研究的患者均簽署知情同意書，并由我院倫理委員會審核通過。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR檢測 經(jīng)纖維食管鏡獲得放射治療前的食管癌活檢組織，新鮮食管癌組織經(jīng)Trizol試劑裂解，以氯仿和異丙醇方法提取組織中RNA。采用ULtraRT one step RT-PCR Kit試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系及條件為：2X ULtraRT one step Buffer 12.5 μL、RNA 1 μg、上下游引物各1 μL、ULtraRT one step EnzymeMix 0.5 μL和無RNA酶的雙蒸水補(bǔ)足25 μL，45 ℃逆轉(zhuǎn)錄30 min、PCR預(yù)變性95 ℃ 2 min(變性94 ℃ 30 s，退火65 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，共40個循環(huán))，終延伸72 ℃ 5 min進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)。EVI1引物F：5′-GATTGCAGAACCCAAGTCAAGT-3′，R：5′-CTATTGGCGCCAAAATAGTCAG-3′；GAPDH引物F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，R：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。以GAPDH為內(nèi)參按照2-ΔΔCt公式計算EVI1 mRNA的相對表達(dá)量。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 食管癌細(xì)胞系ECA109從液氮取出后放入37 ℃水浴鍋中快速復(fù)蘇，800 r/min離心3 min后重懸至含有10%的胎牛血清細(xì)胞培養(yǎng)基中，培養(yǎng)在37 ℃、5% CO2的全濕度培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)基顏色變色時更換新鮮培養(yǎng)基，顯微鏡下觀察，細(xì)胞長滿時胰酶消化進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.3.3 ECA109R細(xì)胞的構(gòu)建 將ECA109細(xì)胞分次遞增輻射，2 Gy劑量輻射3次，4 Gy劑量輻射3次，6 Gy劑量輻射3次和8Gy劑量輻射3次，總計60 Gy。輻射3個左右，輻射后存活的細(xì)胞形成細(xì)胞克隆。 將克隆胰酶消化后擴(kuò)大培養(yǎng)，采用MTS檢測ECA109R細(xì)胞放射IC50值，鑒定細(xì)胞放療抵抗性。ECA109和ECA109R細(xì)胞以每孔3000個細(xì)胞接種至96孔板中，每組包含6個重復(fù)孔，接種12 h后分別進(jìn)行不同劑量的放射處理(0、1、2、4、8、16、32和64Gy)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后加入20μL的MTS試劑，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育2 h，在490 nm處測得細(xì)胞的吸光度(OD值)。細(xì)胞存活率=(放射處理組平均OD值/Gy組平均OD值)×100%。計算細(xì)胞存活率為50%時所對應(yīng)的放射劑量(IC50)。

1.3.4 Western blotting檢測 刮刀收集細(xì)胞，離心后獲得細(xì)胞斑塊，加入RIPA蛋白裂解液，超聲裂解20 min，4 ℃高速離心30 min，獲得細(xì)胞總蛋白。根據(jù)BCA試劑盒說明書測得蛋白濃度，蛋白放置沸水中沸煮5 min進(jìn)行蛋白變性，凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行樣品的蛋白分離，采用電濕轉(zhuǎn)方式將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫孵育1 h，目的一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光法曝光蛋白條帶。

1.3.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 ECA109R細(xì)胞呈對數(shù)生長期時，胰酶消化收集細(xì)胞，并以2×105個細(xì)胞接種至6孔板中，分為對照組(si-NC組)和干擾EVI1表達(dá)組(si-EVI1組)，12 h后采用脂質(zhì)體2000與siRNA混合后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，NC組轉(zhuǎn)染對照siRNA，si-EVI1組轉(zhuǎn)染EVI1 siRNA，8 h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。采用western blotting檢測各組細(xì)胞中EVI1蛋白的表達(dá)。

1.3.6 MTS實驗檢測細(xì)胞存活率 ECA109R細(xì)胞呈對數(shù)生長期時，胰酶消化收集細(xì)胞，并以3000個細(xì)胞接種至96孔板中，每組設(shè)置6個重復(fù)孔，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后分別進(jìn)行不同劑量的放射處理(0、1、2、4、8、16、32和64Gy)，在培養(yǎng)48 h后，更換100 μL新鮮培養(yǎng)基，加入20 μL的MTS試劑，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育2 h，在490 nm處測得細(xì)胞的吸光度(OD值)。細(xì)胞存活率=(si-EVI1組平均OD值/si-NC組平均OD值)×100%。

1.3.7 平板克隆實驗檢測克隆形成率 ECA109R細(xì)胞呈對數(shù)生長期時，胰酶消化收集細(xì)胞，并以500個細(xì)胞接種至6孔板中，每組設(shè)置3個重復(fù)孔，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后按照ECA109R的放射IC50劑量進(jìn)行輻射。轉(zhuǎn)染后放在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d左右，肉眼可觀察到細(xì)胞克隆團(tuán)形成，棄掉培養(yǎng)基，PBS洗兩次，加入甲醇溶液固定細(xì)胞10 min，棄掉甲醇，加入吉姆薩染液染色10 min，雙蒸水洗3洗，晾干后進(jìn)行細(xì)胞克隆計數(shù)，細(xì)胞克隆形成率=(si-EVI1組平均克隆形成數(shù)目/si-NC組平均克隆形成數(shù)目)×100%。

1.3.8 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 采用無EDTA的胰酶消化收集轉(zhuǎn)染siRNA 48 h和經(jīng)ECA109R放射IC50劑量照射的各組細(xì)胞，PBS洗3次后計數(shù)，每管1×106個，每組設(shè)置3個重復(fù)管。按照Annexin V-FITC/PI染色試劑盒說明書，細(xì)胞加入500 μL染色緩沖液重懸后，加入5 μL的Annexin V-FITC 和5 μL PI染色液混勻，常溫孵育10 min，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡率，并計數(shù)各組細(xì)胞平均凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR檢測EVI1在食管癌組織中的表達(dá)及臨床意義 EVI1在低分化組織、臨床分期晚期和放療抵抗食管癌組織中的表達(dá)分別高于在中高分化組織、臨床分期早期和放療敏感的食管癌組織中的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)果表明EVI1的表達(dá)與食管癌患者放療敏感性、分化程度和臨床分期相關(guān)，見表1。

表1 EVI1表達(dá)與食管癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

2.2 EVI1的表達(dá)與食管癌放療敏感性的相關(guān)性 根據(jù)EVI1在食管癌組織中的表達(dá)水平將EVI1的表達(dá)分為EVI1高表達(dá)組(>3.98，38例)和EVI1低表達(dá)組(≤3.98，29例)，采用Spearman等級相關(guān)分析顯示EVI1的表達(dá)與食管癌患者放療敏感性呈負(fù)相關(guān)(r=-0.574，P=0.031)。

2.3 放射抵抗型細(xì)胞株ECA109的構(gòu)建 在相同放射劑量處理下，ECA109細(xì)胞的存活率顯著低于ECA109R細(xì)胞的存活率(P<0.05)，ECA109細(xì)胞的放射IC50劑量為(7.14±1.09)，ECA109R細(xì)胞的放射IC50劑量為(10.32±0.85)。與ECA109細(xì)胞相比，ECA109R細(xì)胞的放射IC50劑量增加(P<0.05)，見表2。

表2 不同放射劑量對ECA109和ECA109R細(xì)胞存活率的影響

2.4 EVI1在ECA109R中的表達(dá) western blotting檢測結(jié)果顯示，EVI1在ECA109細(xì)胞中的相對表達(dá)量為0.35±0.12，在ECA109R細(xì)胞中的相對表達(dá)量為0.97±0.20，與放射敏感性細(xì)胞ECA109相比，EVI1在放射抵抗性細(xì)胞ECA109R中的表達(dá)增加(t=4.604，P=0.006)，見圖1。

圖1 EVI1在放射抵抗性食管癌細(xì)胞ECA109R中的表達(dá)

2.5 EVI1 siRNA的干擾效果 EVI1在si-NC組細(xì)胞中EVI1的表達(dá)量為1.08±0.26，在si-EVI1組細(xì)胞中的表達(dá)量為0.39±0.15，與si-NC組相比，si-EVI1組細(xì)胞中EVI1的表達(dá)降低(t=3.982,P=0.011)，見圖2。

2.6 EVI1siRNA對ECA109R細(xì)胞放療敏感性的影響 在相同放射劑量處理下，si-EVI1組細(xì)胞存活率顯著低于si-NC組細(xì)胞存活率(P<0.05)，si-NC組細(xì)胞的放射IC50劑量為10.03±2.04，si-EVI1組細(xì)胞的放射IC50劑量為8.57±1.02，與si-NC組相比，si-EVI1組細(xì)胞的放射IC50劑量降低(P<0.05)，見表3。

圖2 western blotting檢測EVI1 siRNA干擾效果

表3 EVI1siRNA對ECA109R細(xì)胞放療敏感性的影響

2.7 EVI1siRNA對放療處理的ECA109R細(xì)胞克隆形成率影響 si-NC組細(xì)胞克隆形成率為(100.00±1.00)%，si-EVI1組細(xì)胞克隆形成率為(29.93±4.40)%，與si-NC組相比，si-EVI1組細(xì)胞的克隆形成率降低(t=28.440,P<0.001)，見圖3。

2.8 EVI1siRNA對放療處理的ECA109R細(xì)胞凋亡率影響 si-NC組細(xì)胞凋亡率為3.68±0.47，si-EVI1組細(xì)胞凋亡率為31.95±2.40，與si-NC組相比，si-EVI1組細(xì)胞的凋亡率顯著增加(t=20.030,P<0.001)，見圖4。

2.9 EVI1siRNA對放療處理的ECA109R細(xì)胞相關(guān)蛋白影響 與si-NC組相比，si-EVI1組細(xì)胞中活化caspase 3和Bax蛋白的表達(dá)均增加，Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.015)，見圖5和表4。

3 討論

食管癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，據(jù)估計，我國每年超過45萬例食管癌新發(fā)病例。食管癌的發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)變化很大，在亞洲中具有高發(fā)病率，每年約有一半新診斷的食道癌病例發(fā)生在中國，尤其是在中國中北部地區(qū)和潮汕地區(qū)[11-12]。

圖3 EVI1siRNA對放療處理的ECA109R細(xì)胞克隆形成率的影響

圖4 EVI1siRNA對放療處理的ECA109R細(xì)胞凋亡率的影響

圖5 EVI1siRNA對放療處理的ECA109R細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

表4 各組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的相對表達(dá)量

這可能和食管癌的發(fā)病危險因素相關(guān)，在西方國家食管癌主要是由吸煙引起的[13]，在我國食用熱飲料、亞硝胺、紅肉和微量營養(yǎng)素缺乏癥都與食管癌風(fēng)險較高相關(guān)[14-15]。傳統(tǒng)手術(shù)切除是早期食管癌患者的首選治療方法，但對于晚期食管癌患者，則采用化學(xué)療法或放射療法。其中放射療法顯著提高了食管癌的療效，然而嚴(yán)重的副作用限制了放射療法的應(yīng)用，以及在治療期間經(jīng)常發(fā)生放射抵抗性，使得患者無法獲得理想的臨床療效[3]。因此探索改善食管癌放療抵抗性的分子靶點對提高患者預(yù)后具有重要意義。

EVI1基因座最初在小鼠研究中被強(qiáng)調(diào)為位于引起髓樣腫瘤的常見逆轉(zhuǎn)錄病毒整合基因組位置，其與名為MECOM的MDS1形成融合基因，是正常發(fā)育過程中必不可少的核轉(zhuǎn)錄因子[16]。EVI1的過表達(dá)和激活已被證明可導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定和血液系統(tǒng)相關(guān)腫瘤的發(fā)生[4-6]。EVI1是腫瘤治療的潛在分子靶點，但是其在食管癌中的表達(dá)及其作用未知。為了研究EVI1是否與食管癌放射抵抗相關(guān)，本研究采用qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)EVI1在食管癌中的表達(dá)與患者分化程度、臨床分期和放療敏感性相關(guān)，在食管癌分化程度低、臨床分期晚期和放療抵抗的組織中EVI1的表達(dá)相對較高，表明EVI1高表達(dá)參與食管癌的惡性進(jìn)展。與肝門膽管癌組織樣品中EVI1表達(dá)上調(diào)與腫瘤的組織學(xué)等級和腫瘤大小相關(guān)的研究具有一致性[17]。進(jìn)一步采用spearman等級相關(guān)性分析EVI1的表達(dá)與食管癌放療敏感性的相關(guān)性，結(jié)果顯示EVI1在食管癌中的表達(dá)與患者放療敏感性呈負(fù)相關(guān)，提示EVI1可能參與食管癌的放療抵抗性。

為了進(jìn)一步研究EVI1在食管癌放療抵抗中的作用，本研究采用分次放療遞增法誘導(dǎo)食管癌放療抵抗細(xì)胞株ECA109R，并采用MTS對其抵抗性進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示在相同放射劑量下，食管癌放射敏感細(xì)胞ECA109的細(xì)胞存活率低于ECA109R細(xì)胞，并且ECA109細(xì)胞的放射IC50劑量值低于ECA109R細(xì)胞的放射IC50劑量值，表明ECA109R細(xì)胞成功誘導(dǎo)。并且western blotting檢測發(fā)現(xiàn)EVI1在ECA109R細(xì)胞中的表達(dá)高于在ECA109細(xì)胞中的表達(dá)，與其在組織水平中的表達(dá)具有一致性。采用siRNA轉(zhuǎn)染ECA109R細(xì)胞研究干擾EVI1的表達(dá)對食管癌細(xì)胞放療敏感性的影響，結(jié)果顯示與對照si-NC組相比，在相同放射劑量下，si-EVI1組ECA109R的放射IC50劑量值較低。且干擾EVI1的表達(dá)后，ECA109R細(xì)胞的克隆形成率降低，細(xì)胞凋亡率增加，表明EVI1促進(jìn)食管癌細(xì)胞的放射抵抗，與Lu等[10]的研究報道一致。EVI1在食管癌放射抵抗中發(fā)揮作用的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究，細(xì)胞凋亡是放射殺傷腫瘤細(xì)胞抑制腫瘤惡性進(jìn)展的重要作用機(jī)制[18]。而活化caspase 3蛋白是細(xì)胞發(fā)生凋亡的不可逆性標(biāo)志，發(fā)揮促凋亡作用[19]。Bcl-2家族是調(diào)控細(xì)胞凋亡途徑的另一重要凋亡蛋白，參與放射抑制腫瘤細(xì)胞存活的生物過程[20-21]。本研究采用western blotting檢測發(fā)現(xiàn)干擾EVI1的表達(dá)后，ECA109R細(xì)胞中促凋亡蛋白活化caspase 3和Bax蛋白的表達(dá)增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)降低。表明EVI1通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白促進(jìn)食管癌細(xì)胞的放射抵抗作用。

4 結(jié)論

EVI1在食管癌放射抵抗組織中表達(dá)增加，與食管癌患者放射治療敏感性呈負(fù)相關(guān)，干擾EVI1的表達(dá)通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白可增加食管癌細(xì)胞的放射敏感性。