微波消解－原子吸收火焰法測(cè)定肝精補(bǔ)血素口服液中總鐵含量*

申二永，金建聞，李 楊

（1. 河南省食品藥品檢驗(yàn)所·國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥材及飲片質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450018；2. 河南省食品藥品審評(píng)查驗(yàn)中心，河南 鄭州 450018）

肝精補(bǔ)血素口服液是由肝精膏（由鮮豬肝提取）、黨參、枸杞子、枸櫞酸鐵銨、維生素B15 種原料制成的非處方藥，具有養(yǎng)血益氣、滋補(bǔ)肝腎功效，對(duì)于緩解貧血癥狀和提升血紅蛋白水平療效較好，可用于成人及兒童缺鐵性貧血的治療。肝精補(bǔ)血素口服液對(duì)改善缺鐵性貧血的癥狀，顯著強(qiáng)于西藥鐵制劑［1－3］。枸櫞酸鐵銨為有機(jī)鐵劑，是該方中核心的造血原料，故需控制好總鐵含量。肝精補(bǔ)血素口服液現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑（第十三冊(cè)）》（WS3－B－2530－97）［4］。經(jīng)實(shí)際檢驗(yàn)及調(diào)研生產(chǎn)企業(yè)，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的方法存在含量偏低和重復(fù)性差的問題，各相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)均建議修訂或提高該檢驗(yàn)方法。本研究中建立了微波消解－原子吸收火焰法測(cè)定肝精補(bǔ)血素口服液中總鐵含量的方法［5－7］。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AAS－ZEEnit700 P 型原子吸收分光光度計(jì)（德國(guó)耶拿分析儀器股份公司）；GBC SavantAA 型原子吸收分光光度計(jì)（澳大利亞GBC 公司，配有AS－1 型鐵空心陰極燈）；MARS6 型微波消解儀（美國(guó)CEM 公司）；Milli－Q型超純水處理系統(tǒng)（美國(guó)Millipore 公司）。

1.2 試藥

鐵元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（標(biāo)示質(zhì)量濃度為1 000 mg／L，批號(hào)為19C006－8，國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心）；65%純硝酸（優(yōu)級(jí)純，德國(guó)Merck 公司）。肝精補(bǔ)血口服液（廠家A，河南靈佑藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)分別為20140805，20150510，20150805；廠家B，河南省奧林特藥業(yè)有限公司，批號(hào)分別為170101，170102，180901，180902，190801，191213，200301，200302；廠家C，開封康諾藥業(yè)有限公司，批號(hào)分別為H18010，H18012，H18013，H18014，H18015，H18016，H18017，H18018，H18019，H18020）。

2 方法與結(jié)果

2.1 元素測(cè)定條件

測(cè)定波長(zhǎng)：248.3nm；燈電流：4mA；狹縫寬度：0.2 nm。采用對(duì)應(yīng)的空心陰極燈，火焰原子吸收法測(cè)定鐵（Fe），氘燈背景校正［8－11］。

2.2 微波消解程序升溫條件［12－13］

詳見表1。

2.3 溶液制備

精密量取本品1 mL，置適宜的聚四氟乙烯消解罐內(nèi)，加入硝酸10 mL，混勻，蓋好蓋子，置微波消解爐內(nèi)按程序升溫條件進(jìn)行消解。消解完全后，趕酸，剩余液體用2% 硝酸溶液轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，精密量取2 mL，用2%硝酸溶液稀釋至20 mL 容量瓶中，搖勻，作為供試品溶液。同法制備試劑空白溶液。

表1 微波消解程序升溫條件Tab.1 Temperature－programmed conditions of microwave digestion

2.4 方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線建立：取鐵元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度為1 000 mg／L），用2%硝酸溶液分別稀釋制成質(zhì)量濃度為0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mg／L 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以質(zhì)量濃度（X，mg／L）為橫坐標(biāo)、吸光度（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按2.1 項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，得線性回歸方程Y ＝0.006 9 X ＋0.062 7，r ＝0.999 2（ n ＝6）。結(jié)果表明，總鐵質(zhì)量濃度在0.5 ～5.0 mg／L 范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取適量鐵元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，加2%硝酸溶液，配制得質(zhì)量濃度為3 mg／L 的對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下測(cè)定條件，連續(xù)測(cè)定6 次。結(jié)果的RSD 為1.42%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為H18016）6 份，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液并測(cè)定。結(jié)果鐵吸收度的RSD 為1.13%（n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（開封康諾藥業(yè)有限公司，批號(hào)為H18016），按供試品溶液制備方法制備，分別于0，2，4，8，12，24 h 時(shí)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果鐵吸收度的RSD 為1.01%（n ＝6），表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為H18016，鐵質(zhì)量濃度為1.498 mg／mL）0.5 mL，量取9 份，分別精密加入鐵元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度為1 000 mg／L）0.4，0.5，0.6 mL，按2.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液。精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液，分別注入液相色譜儀，測(cè)定鐵的含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

2.5 不同人員操作及新舊方法結(jié)果比較

原容量法標(biāo)準(zhǔn)：精密量取樣品10 mL，置250 mL 碘量瓶中，加水10 mL，加硫酸溶液（1 ∶1，V／ V）2 mL，搖勻，放冷至15℃，加入1%高錳酸鉀溶液6mL，鹽酸15mL，40%碘化鉀溶液5 mL，搖勻，在暗處放置15 min，加水50 mL，用硫代硫酸鈉液（0.05 mol／L）滴定，近終點(diǎn)時(shí)加入淀粉指示液2 mL，繼續(xù)滴定至紫色消失，并將滴定結(jié)果用空白試驗(yàn)校正（試劑中不加1%高錳酸鉀液），即得每1 mL 硫代硫酸鈉液質(zhì)量濃度（0.05 mol／L）相當(dāng)于2.792 5 mg 的鐵溶液。取樣品13 批，分別按原容量法標(biāo)準(zhǔn)及原子吸收火焰法操作，對(duì)不同人員操作及新舊方法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果見表3。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n ＝9）Tab.2 Results of the recovery test（n ＝9）

表3 不同人員操作及新舊方法測(cè)定結(jié)果比較（mg／mL）Tab.3 Comparison of the results between two operators with new and old methods（mg／mL）

2.6 不同品牌儀器測(cè)定結(jié)果比較

取樣品3 批（批號(hào)分別為H18016，H18017，H18018），按2.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，采用火焰法測(cè)定，分別采用德國(guó)耶拿AAS－ZEEnit700P 型、澳大利亞GBC SavantAA型原子吸收分光光度計(jì)，按2.1 項(xiàng)下條件測(cè)定。結(jié)果見表4。表明使用不同品牌儀器的含量測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定。

2.7 樣品含量測(cè)定

取21 批樣品，依法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下元素測(cè)定條件和2.2 項(xiàng)下微波消解程序升溫條件測(cè)定樣品中總鐵的含量。結(jié)果見表5。

3 討論

3.1 容量法問題和限度規(guī)定不嚴(yán)謹(jǐn)

1）試驗(yàn)方法。查閱現(xiàn)行部頒標(biāo)準(zhǔn)的起草說明，該標(biāo)準(zhǔn)采用的容量法主要參照了枸櫞酸鐵銨的含量測(cè)定方法，原理為枸櫞酸鐵銨加酸變成三價(jià)鐵離子（Fe3＋），利用Fe3＋在酸性條件下氧化碘化鉀析出碘，用硫代硫酸鈉溶液滴定，以測(cè)定含量。由于肝精補(bǔ)血素口服液為復(fù)方制劑，該方法并不完全適用于該劑型的測(cè)定。由表3可見，同一批樣品不同人員測(cè)定結(jié)果差距大，結(jié)論也不同，易造成市場(chǎng)監(jiān)督抽驗(yàn)出現(xiàn)爭(zhēng)議。分析原因，滴定終點(diǎn)判斷是顏色由黃紫色變成淡黃色（標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定滴定至紫色消失），由于輔料和其他藥味的干擾（該藥品性狀為暗紅色的澄清液體），造成該滴定終點(diǎn)不易判斷，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果因人而異。同時(shí)，3 家生產(chǎn)企業(yè)均反映樣品在保質(zhì)期內(nèi)，枸櫞酸鐵銨可能會(huì)逐漸與其他輔料發(fā)生反應(yīng)，形成其他價(jià)態(tài)，導(dǎo)致部分消耗，而原容量法的前處理并不能完全將所有價(jià)態(tài)的鐵轉(zhuǎn)化為Fe3＋，易造成近效期的樣品含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)一步降低。

表4 不同品牌原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定結(jié)果比較（mg／mL）Tab.4 Comparison of results between two brands of atomic absorption spectrophotometers（mg／mL）

表5 樣品總鐵含量測(cè)定結(jié)果（mg／mL）Tab.5 Results of content determination of total iron in the samples（mg／mL）

2）限度規(guī)定。標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定限值為每1 mL 不得少于1 mg，按照檢驗(yàn)結(jié)果修約，其范圍為0.6 ～1.4 mg，范圍過寬，同樣會(huì)導(dǎo)致市場(chǎng)監(jiān)督抽驗(yàn)出現(xiàn)爭(zhēng)議。

3.2 投料問題

經(jīng)調(diào)研生產(chǎn)企業(yè)發(fā)現(xiàn)，企業(yè)在實(shí)際生產(chǎn)中購(gòu)進(jìn)的枸櫞酸鐵銨中總鐵的含量為20.5% ～22.5%，根據(jù)處方投料5 g 枸櫞酸鐵銨制成成品，成品中總鐵的含量應(yīng)為每1 mL 含1.025 ～1.125 mg。由于原標(biāo)準(zhǔn)存在3.1 項(xiàng)下的2 個(gè)問題，3 家生產(chǎn)企業(yè)在實(shí)際生產(chǎn)中，為避免產(chǎn)品總鐵含量低于限度規(guī)定或避免爭(zhēng)議，實(shí)際投料均為6 ～8 g，投料量超出處方規(guī)定的20% ～60%。

3.3 樣品前處理方式考察和方法選擇

根據(jù)投料量折算，樣品需稀釋500 倍，考察了直接稀釋法、直接稀釋加離子釋放劑（氯化鍶）法、濕法消解及微波消解法。結(jié)果表明，直接稀釋法和直接稀釋加離子釋放劑（氯化鍶）法，上機(jī)樣品溶液盡管有機(jī)物含量低于1%，但由于樣品是直接稀釋，口服液中的糖分和其他輔料會(huì)干擾測(cè)定，造成測(cè)定數(shù)據(jù)不穩(wěn)定，同時(shí)回收率過高，超出相關(guān)技術(shù)要求的規(guī)定，故不采用上述兩法。濕法消解和微波消解法回收率均較理想，可采用該兩法，考慮到濕法消解時(shí)間較長(zhǎng)及所需試劑量較多，故優(yōu)先選擇微波消解法?？傝F的測(cè)定現(xiàn)行方法主要有容量法、原子吸收火焰法、電感耦合等離子體－質(zhì)譜法，考慮到鉻超標(biāo)藥用膠囊事件后，各藥品生產(chǎn)企業(yè)均配備了原子吸收分光光度計(jì)及微波消解儀，而電感耦合等離子體－質(zhì)譜儀價(jià)格昂貴，使用成本偏高，故優(yōu)先選用微波消解－原子吸收火焰法測(cè)定總鐵含量。

3.4 限度擬訂

處方中枸櫞酸鐵銨投料量為5 g，成品理論每1 mL應(yīng)含總鐵1.025 ～1.125 mg，參考原標(biāo)準(zhǔn)“本品含枸櫞酸鐵銨，以鐵計(jì)算，每1 mL 不得少于1 mg”，建議限度按照理論值的90%計(jì)算，擬定為“本品含枸櫞酸鐵銨，以鐵計(jì)算，每1 mL 不得少于0.90 mg”。

3.5 方法評(píng)價(jià)

采用新建立的微波消解－原子吸收火焰法測(cè)定總鐵的含量，避免了原容量法存在的終點(diǎn)不易判斷的問題及枸櫞酸鐵銨的損失問題，解決了企業(yè)困擾的投料問題，方法簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，精密度高，可用于肝精補(bǔ)血素口服液的質(zhì)量控制。