龍脊稻作梯田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能類(lèi)群及影響因子分析

王曉彤，靳振江，2，3*，周軍波，程躍揚(yáng)，袁武，潘復(fù)靜，2，3，劉德深，2，3

（1.桂林理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，廣西桂林 541004；2.桂林理工大學(xué)巖溶地區(qū)水污染控制與用水安全保障協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西桂林 541004；3.桂林理工大學(xué)廣西環(huán)境污染控制理論與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林 541004）

梯田是沿等高線修筑的階梯狀農(nóng)田，是人為開(kāi)墾又與獨(dú)特的自然氣候和地理因素密切相關(guān)的山地耕作生態(tài)系統(tǒng)，其垂直特性是區(qū)別于其他農(nóng)業(yè)土地利用方式的顯著特征[1]。與普通稻田相比，稻作梯田屬于山坡耕地，梯田獨(dú)特的構(gòu)造能夠增加地表水的下滲量，減緩水流對(duì)土壤的沖刷[2]，有效防止土壤侵蝕，梯田形式能夠有效改善土壤養(yǎng)分狀況，改善立地條件。梯田海拔高度的變化會(huì)導(dǎo)致土壤養(yǎng)分含量、溫度、水分等也隨之變化[3-4]，并且梯田的光能利用率普遍高于一般農(nóng)耕地，有助于梯田土壤利用率，發(fā)揮梯田效益[5]。我國(guó)的稻作梯田主要分布在南方亞熱帶和熱帶的丘陵和山地地區(qū)。在2018 年第五次全球重要農(nóng)業(yè)文化遺產(chǎn)國(guó)際論壇上，包括龍脊稻作梯田在內(nèi)的4個(gè)南方山地稻作梯田被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織列入全球重要農(nóng)業(yè)文化遺產(chǎn)名錄[6]。因此，探討稻作梯田的維持機(jī)制有利于農(nóng)業(yè)文化遺產(chǎn)的保護(hù)和稻作梯田管理的持續(xù)性。

土壤微生物是評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量和健康狀況的重要指標(biāo)之一，對(duì)土壤pH 和養(yǎng)分等環(huán)境因子的變化十分敏感[7]。在稻作梯田中，土壤微生物在梯田土壤的生物地球化學(xué)循環(huán)過(guò)程中具有重要的作用[8]。目前，關(guān)于梯田土壤微生物方面的研究已有報(bào)道，梁勇等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，元陽(yáng)梯田稻田土壤微生物數(shù)量總體上在低海拔（1 450～1 500 m）稻田較高，土壤自生固氮菌、放線菌、細(xì)菌和真菌、纖維分解菌的數(shù)量受季節(jié)的影響明顯。王燦等[9]發(fā)現(xiàn)，紫外線輻射能夠顯著降低水稻孕穗期、抽穗期和成熟期稻田土壤微生物量碳。這些研究表明，土壤微生物易受水稻生長(zhǎng)的影響。另外，古梯田水稻土不同年代序列古菌豐度也有報(bào)道[10]。而在休閑期，土壤的干擾較少，微生物相對(duì)穩(wěn)定，但對(duì)休閑期細(xì)菌多樣性還鮮有研究；而且，土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能類(lèi)群受哪些重要土壤理化因子的影響尚不清楚。因此，選擇休閑期的龍脊稻作梯田為研究對(duì)象，開(kāi)展兩個(gè)方面的研究：一是分析梯田土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢(shì)功能類(lèi)群特征；二是明晰梯田土壤中影響優(yōu)勢(shì)微生物群落和功能類(lèi)群的重要環(huán)境因子，以期豐富稻作梯田基礎(chǔ)理論，為稻作梯田的管理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

龍脊稻作梯田距今已有600 多年的歷史[11]，堪稱(chēng)世界梯田原鄉(xiāng)，位于廣西壯族自治區(qū)龍勝各族自治縣龍脊鎮(zhèn)平安村龍脊山，距桂林市約80 km。龍脊稻作梯田地處亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，年平均氣溫18.1 ℃，極端最高溫度39.5 ℃，極端最低溫度-4.8 ℃，無(wú)霜期314 d，年降雨量1 500～2 400 mm，年均日照時(shí)數(shù)1 223 h，年均空氣相對(duì)濕度82%。龍脊稻作梯田分布在海拔850～1 060 m 之間，位于東經(jīng)109°32′～110°14′、北緯25°35′～26°17′之間[12]。龍脊稻作梯田高海拔、低氣溫，主要種植粳稻，為單季稻，產(chǎn)量一般為6 000～7 500 kg·hm-2。通常5 月下旬開(kāi)始灌水插秧，9 月下旬到10 月上旬成熟，收割后秸稈不還田。施肥以無(wú)機(jī)復(fù)合肥為主，插秧前施用無(wú)機(jī)復(fù)合肥作為基肥，用量為1 050～1 500 kg·hm-2，后期追肥視水稻生長(zhǎng)狀況而定。

1.2 供試土壤與樣品采集

2016 年3 月27 日和3 月28 日，在龍脊梯田景區(qū)沿梯田海拔（ALS）高度，大致按照10 m高度差進(jìn)行采樣（圖1），共19 個(gè)樣地，參考《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》[13]進(jìn)行土壤樣品采集。在每個(gè)樣地中隨機(jī)選取3個(gè)采樣點(diǎn)，每個(gè)樣點(diǎn)采取等量均勻的0～20 cm 耕層土壤[14]，3 個(gè)樣點(diǎn)均勻混合為1 個(gè)樣本。樣本帶回實(shí)驗(yàn)室后，去除植物根系和石塊等雜物，一部分研磨過(guò)2 mm 篩，放入-80 ℃冰箱儲(chǔ)存，用于后續(xù)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析；另一部分在陰涼處自然風(fēng)干后研磨，分別過(guò)0.85、0.25、0.15 mm 篩后于陰涼處保存，用于測(cè)定土壤理化性質(zhì)。

1.3 土壤理化指標(biāo)及養(yǎng)分含量的測(cè)定

土壤理化性質(zhì)的分析方法參照《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》[13]進(jìn)行，設(shè)樣點(diǎn)平行組。土壤含水率（SWC）的測(cè)定采用烘干法；pH 的測(cè)定采用無(wú)CO2蒸餾水作浸提劑，按照土水1∶2.5的比例浸提，用精密pH計(jì)（型號(hào)：IS128C）直接測(cè)定；土壤有效磷（AP）采用鹽酸-氟化銨法測(cè)定；土壤有機(jī)碳（SOC）采用濃硫酸-重鉻酸鉀外加熱法測(cè)定；堿解氮（AN）采用堿解擴(kuò)散法測(cè)定；土壤總氮（TN）采用濃硫酸消煮-凱氏定氮法測(cè)定；土壤總磷（TP）采用碳酸鈉熔融法測(cè)定。土壤理化性質(zhì)見(jiàn)表1。

1.4 高通量測(cè)序

用混合樣進(jìn)行微生物測(cè)序。使用環(huán)境樣本DNA提取試劑盒（Power Soil，QIAGEN 公司）進(jìn)行基因組DNA 抽提后，使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA。按指定測(cè)序區(qū)域，合成帶有Barcode 的特異引物對(duì)樣本的16S rRNA V4 區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增[15]，引物序列為515F（5′-GTG YCA GCM GCC GCG GTA A-3′）和806R（5′-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3′）。每個(gè)樣本進(jìn)行3 次重復(fù)，每個(gè)PCR 反應(yīng)終止于線性擴(kuò)增期。PCR 結(jié)束后，將同一樣本的PCR 產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用OMEGA 膠回收試劑盒切膠回收PCR 產(chǎn)物，TE 緩沖液洗脫回收目標(biāo)DNA 片段。測(cè)序由成都羅寧生物公司采用PE250 測(cè)序方式在Illumina 測(cè)序技術(shù)的分析平臺(tái)上完成。雙端測(cè)序得到的PE reads首先使用FLASH進(jìn)行拼接，同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行控制，在去除低質(zhì)量堿基及接頭污染序列等操作過(guò)程后完成數(shù)據(jù)過(guò)濾，得到可供后續(xù)分析的高質(zhì)量目標(biāo)序列。在97%的相似水平上使用UPARSE 算法（默認(rèn)）進(jìn)行OTUs（可操作分類(lèi)單元）的聚類(lèi)。挑選出OTUs 的代表性序列。使用Uchime 去除嵌合體。使用SILVA 等數(shù)據(jù)庫(kù)（默認(rèn)）或Greengene進(jìn)行物種分類(lèi)信息的劃分，同時(shí)去除注釋為葉綠體、線粒體以及非細(xì)菌或古菌界的OTUs。α-多樣性可以反映細(xì)菌群落的豐度和多樣性，通過(guò)Chao 指數(shù)和Ace 指數(shù)來(lái)分析樣品中細(xì)菌群落的豐富度，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)來(lái)分析樣品中細(xì)菌群落的多樣性，Observed 和Coverage指數(shù)來(lái)表示測(cè)序深度。

圖1 采樣點(diǎn)示意圖Figure 1 Schematic diagram of sampling points

表1 龍脊稻作梯田土壤的理化性質(zhì)Table 1 Physico-chemical properties of paddy soils in Longji rice terraces（0～20 cm）

1.5 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

采用EXCEL 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，使用FAPROTAX在線軟件進(jìn)行細(xì)菌功能預(yù)測(cè)，基于SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建細(xì)菌域全譜系的基因功能圖譜，進(jìn)行細(xì)菌功能分類(lèi)預(yù)測(cè)。用SPSS 25.0 進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析，使用OmicShare Tools 進(jìn)行主成分分析（PCoA）。用Origin 2017 繪制優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)和屬的群落組成圖。將數(shù)量占總OTUs 數(shù)0.3%以上的OTUs 界定為優(yōu)勢(shì)OTUs[16]，利用Rstudio 和TBtools 繪制優(yōu)勢(shì)OTUs 和細(xì)菌功能類(lèi)群與環(huán)境因子的相關(guān)性熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 龍脊稻作梯田稻田土壤細(xì)菌的多樣性分析

本研究中，19 個(gè)采樣點(diǎn)共得到3 991 個(gè)細(xì)菌OTUs，它們分屬于細(xì)菌界的48 門(mén)、112 綱、239 目、454科和792 屬。從圖2 龍脊稻作梯田稻田土壤細(xì)菌的α-多樣性可知，反映細(xì)菌群落豐富度的Chao1指數(shù)和Ace 指數(shù)分別為1 183～1 984和1 295～2 173；反映細(xì)菌群落多樣性的Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)分別為4.52～5.16 和0.946～0.976 之間；表示測(cè)序深度的Observed指數(shù)和Coverage指數(shù)分別為819～1 271和0.932～0.961。從表2 土壤環(huán)境因子與土壤微生物α-多樣性之間的相關(guān)性可知，Simpson 指數(shù)與ALS 呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），而與土壤pH 呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），說(shuō)明土壤細(xì)菌多樣性受到ALS和土壤pH的影響。

圖2 龍脊稻作梯田土壤微生物α-多樣性指數(shù)Figure 2 Soil microbial α-diversity index in Longji rice terraces

表2 土壤微生物α-多樣性與環(huán)境因子之間的相關(guān)性（r）Table 2 Correlation between soil microbial α-diversity and environmental factors（r）

基于Bray-Curtis 距離算法對(duì)不同樣點(diǎn)土壤細(xì)菌群落組成進(jìn)行主成分分析（PCoA），結(jié)果如圖3 所示，軸1和軸2的差異貢獻(xiàn)值共為37.91%。從圖3可以看出，樣點(diǎn)18 和19、樣點(diǎn)16 和17、樣點(diǎn)13 和14、樣點(diǎn)8和9、樣點(diǎn)3 和4、樣點(diǎn)6 和7 與樣點(diǎn)1 和2 兩兩之間在海拔高度上比較接近，表明細(xì)菌β-多樣性樣點(diǎn)在海拔高度上的分布以小集群分布為主。

圖3 龍脊稻作梯田細(xì)菌β-多樣性基于Bray-Curtis距離算法的主成分分析Figure 3 Principal component analysis of bacterial β-diversity in Longji rice terraces based on Bray-Curtis distance algorithm

2.2 龍脊稻作梯田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

本研究把篩選到門(mén)和屬水平的OTUs 序列豐度占總OTUs 豐度0.3%以上定義為優(yōu)勢(shì)門(mén)和優(yōu)勢(shì)屬，Others 表示未分類(lèi)的和OTUs 序列豐度占總OTUs 豐度0.3%以下的門(mén)和屬。土壤細(xì)菌在門(mén)和屬水平的組成及相對(duì)豐度如圖4所示。

從圖4a 可以看出，在門(mén)水平上，龍脊稻作梯田共有變形菌門(mén)（Proteobacteria）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、WD272 門(mén)、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、浮霉菌門(mén)（Planctomycetes）、硝化螺旋菌門(mén)（Nitrospirae）和疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia）等11 個(gè)優(yōu)勢(shì)門(mén)，它們的豐度分別為49.22%、29.18%、5.32%、4.18%、3.76%、2.98%、1.61%、1.06%、0.71%、0.66%和0.40%，其OTUs 豐度合計(jì)占細(xì)菌總OTUs的99.08%。從圖4b可以看出，在屬水平上，龍脊稻作梯田共有鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、羅思河小桿菌屬（Rhodanobacter）、酸桿菌屬（Acidibacter）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）和端瘤桿菌屬（Telmatobacter）、青枯菌屬（Ralstonia）、嗜酸棲熱菌屬（Acidothermus）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、假雙頭斧形菌屬（Pseudolabrys）、土壤芽孢桿菌屬（Solibacillus）、芽孢八疊球菌屬（Sporosarcina）、嗜冷芽孢桿菌屬（Psychrobacillus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、陶厄氏菌屬（Thauera）、Rhizomicrobium屬和假單胞菌屬（Pseudomonas）等16個(gè)優(yōu)勢(shì)屬，OTUs豐度合計(jì)占細(xì)菌總OTUs 的33.98%。其中樣點(diǎn)5、11、16、17、18和19 的最優(yōu)勢(shì)屬和次優(yōu)勢(shì)屬分別為羅思河小桿菌屬和鞘氨醇單胞菌屬，豐度分別為8.72%～21.53%和7.13%～10.27%；其余13 個(gè)樣點(diǎn)的最優(yōu)勢(shì)屬和次優(yōu)勢(shì)屬分別為鞘氨醇單胞菌屬和羅思河小桿菌屬，豐度分別為8.70%～20.87%和2.34%～11.57%。

圖4 龍脊稻作梯田細(xì)菌門(mén)（a）和屬水平（b）的群落組成Figure 4 Bacterial community composition at the level of phylum（a）and genus（b）in Longji rice terraces

2.3 龍脊稻作梯田細(xì)菌群落與環(huán)境因子的相關(guān)分析

細(xì)菌優(yōu)勢(shì)OTUs與環(huán)境因子的相關(guān)性分析結(jié)果如圖5 所示，pH 與OTU36（Rhodospirillales，紅螺菌目）等4 個(gè)優(yōu)勢(shì)OTUs 呈顯著的正相關(guān)關(guān)系，與OTU1（Sphingomonas，鞘氨醇單胞菌屬）和OTU2（Chloroflexi，綠彎菌門(mén)）呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。ALS 與OTU23（Ktedonobacteria，纖線桿菌綱）等3 個(gè)優(yōu)勢(shì)OTUs 呈顯著的正相關(guān)關(guān)系，與OTU496（Psychrobacillus，嗜冷芽孢桿菌屬）和OTU89（紅螺菌目）呈顯著負(fù)相關(guān)。

圖5 龍脊稻作梯田細(xì)菌優(yōu)勢(shì)OTUs與環(huán)境因子的相關(guān)性Figure 5 Correlation between bacterial OTUs for advantage and environmental factors of Longji rice terraces

AN 與OTU20（綠彎菌門(mén)）等4 個(gè)優(yōu)勢(shì)OTUs 呈顯著正相關(guān)，與OTU10（纖線桿菌綱）呈顯著負(fù)相關(guān)；C/N 與OTU9（Gemmatimonadaceae，芽單胞菌科）等5個(gè)優(yōu)勢(shì)OTUs 呈顯著正相關(guān)，與OTU4789（綠彎菌門(mén)）呈顯著負(fù)相關(guān)。另外，AP 與3 個(gè)優(yōu)勢(shì)OTUs 呈顯著正相關(guān)，SOC 和TP 均與1 個(gè)優(yōu)勢(shì)OTUs 呈顯著正相關(guān)。以上結(jié)果表明，影響龍脊稻作梯田土壤細(xì)菌群落豐度的主要環(huán)境因子為pH、C/N、AN和ALS。

2.4 龍脊稻作梯田土壤細(xì)菌功能的預(yù)測(cè)

圖6 是龍脊稻作梯田土壤細(xì)菌功能菌與土壤理化因子的相關(guān)性熱圖，共獲得51 個(gè)功能類(lèi)群，相對(duì)豐度占總OTUs 相對(duì)豐度的70.36%。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，C/N 與發(fā)酵類(lèi)、碳?xì)浠衔锝到忸?lèi)、芳族烴降解類(lèi)和脂肪族非甲烷烴降解類(lèi)等4 個(gè)功能類(lèi)群豐度呈顯著正相關(guān)，與好氧氨氧化菌功能類(lèi)群豐度呈顯著負(fù)相關(guān)；pH 與暗氫氧化類(lèi)和碳?xì)浠衔锝到忸?lèi)、捕食者或外來(lái)寄生蟲(chóng)類(lèi)、芳族烴降解類(lèi)和脂肪族非甲烷烴降解類(lèi)等5 個(gè)功能類(lèi)群的豐度呈顯著正相關(guān)；ALS 與3類(lèi)硫呼吸類(lèi)功能細(xì)菌呈顯著正相關(guān)，與胞內(nèi)寄生類(lèi)細(xì)菌呈顯著負(fù)相關(guān)；AN與反硝化作用類(lèi)、一氧化二氮反硝化作用類(lèi)、硝酸鹽反硝化類(lèi)和亞硝酸鹽反硝化類(lèi)等4 個(gè)功能類(lèi)群豐度呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。另外，TN與2個(gè)功能類(lèi)細(xì)菌呈顯著正相關(guān)，含水率、AP和TP分別與1 個(gè)功能類(lèi)細(xì)菌呈顯著正相關(guān)。以上結(jié)果表明，影響龍脊稻作梯田土壤細(xì)菌群落功能類(lèi)群的主要環(huán)境因子為pH、C/N、ALS和AN。

3 討論

3.1 龍脊稻作梯田細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤因子的關(guān)系

土壤微生物的群落組成及多樣性是反映土壤微生物群落生態(tài)功能的重要指標(biāo)[16-18]。在本研究中，Simpson 指數(shù)與ALS 和pH 分別呈顯著負(fù)相關(guān)和顯著正相關(guān)，說(shuō)明海拔的降低和pH 的提高均會(huì)增強(qiáng)土壤微生物的物種多樣性和均勻度，從而增加土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。土壤微生物和土壤環(huán)境因子都是維持土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定的重要組成部分[19]，微生物的豐富度和數(shù)量的增大都會(huì)使整個(gè)土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性得到明顯提升，也使其多樣性十分明顯[20]。張媚等[21]研究表明，山核桃園土壤pH值降低，土壤微生物的多樣性也隨之降低，土壤微生物優(yōu)勢(shì)菌群的群落結(jié)構(gòu)改變，山核桃樹(shù)體抗蟲(chóng)抗病能力減弱。相似的結(jié)果也出現(xiàn)在茶園中，當(dāng)茶園土壤pH 低于6.0 時(shí)，微生物的生長(zhǎng)活性隨之減弱[22]；反之，施用石灰將土壤pH 從4.1提高至6.88，土壤中細(xì)菌和放線菌數(shù)量提高近百倍[23]，從而改善茶樹(shù)長(zhǎng)勢(shì)。由此說(shuō)明土壤微生物多樣性與土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性之間息息相關(guān)。土壤pH會(huì)直接影響植物生長(zhǎng)和生理代謝，從而影響其對(duì)土壤養(yǎng)分的吸收利用，在土壤能量流動(dòng)和物質(zhì)循環(huán)過(guò)程中又反過(guò)來(lái)影響土壤微生物的多樣性[21]。侯建偉等[24]研究發(fā)現(xiàn)，隨著土壤pH 的升高，細(xì)菌群落Simpson 指數(shù)也隨之增加，說(shuō)明pH 是決定細(xì)菌Simpson 多樣性指數(shù)的重要因素[25]。在本研究中，受地質(zhì)背景影響，龍脊稻作梯田土壤pH值呈酸性，梯田開(kāi)墾時(shí)間早，耕作時(shí)間長(zhǎng)，土壤受人為干擾強(qiáng)烈[8]，不同樣地之間肥料施用的種類(lèi)、用量和時(shí)間差異較大，影響了細(xì)菌群落多樣性。從這個(gè)意義上說(shuō)，提高土壤pH 可以提高土壤微生物多樣性和均勻度，從而增強(qiáng)龍脊稻作梯田土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。有研究表明，麥作耕地環(huán)境pH 值從4.0 升至8.3 時(shí)，相應(yīng)的細(xì)菌拷貝數(shù)也隨之增加了約3 倍，且細(xì)菌群落多樣性也增加了1 倍[26-27]。茶園常用石灰調(diào)節(jié)酸性土壤pH，pH 每升高1～2 個(gè)單位，土壤細(xì)菌數(shù)量會(huì)增加10 倍以上[28]。細(xì)菌群落生長(zhǎng)和pH 值正相關(guān)，并且這種現(xiàn)象不會(huì)因土壤類(lèi)型不同而變化[29]。

圖6 龍脊稻作梯田土壤理化因子與細(xì)菌功能類(lèi)群相關(guān)熱圖Figure 6 Heatmap of soil physicochemical factors with bacterial functional group in Longji rice terraces

在門(mén)水平上，變形菌門(mén)為最優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。在三江平原濕地[30]、松花江下游沿江濕地[31]、秦嶺中段北坡[32]和青藏高原[33]不同生境的土壤中，變形菌門(mén)也是細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，表明該門(mén)的細(xì)菌有較寬的生態(tài)位，對(duì)土壤環(huán)境有高度適應(yīng)性。理鵬等[34]研究表明，變形菌門(mén)細(xì)菌的代謝與碳氮循環(huán)密切相關(guān)，高豐度的變形菌門(mén)有利于土壤肥力的保持。在本研究中，β-變形菌、δ-變形菌和α-變形菌均屬于變形菌門(mén)中的優(yōu)勢(shì)綱，β-變形菌可降解烴類(lèi)芳香族類(lèi)化合物，參與氮循環(huán)。δ-變形菌在化能自養(yǎng)的代謝過(guò)程中通過(guò)還原硫酸鹽升高生境的pH[35]。α-變形菌包含與植物進(jìn)行共生作用的細(xì)菌（如根瘤菌屬）[36]，表明這個(gè)門(mén)的細(xì)菌群落在水稻吸收利用土壤養(yǎng)分的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。圖5 相關(guān)性分析表明，土壤微生物群落組成和豐度受pH、ALS、AN 和C/N 這些驅(qū)動(dòng)因子的敏感調(diào)節(jié)。有研究顯示，土壤pH 是影響土壤新陳代謝和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的重要因子[37-39]，能顯著影響稻田中細(xì)菌的多樣性和細(xì)菌類(lèi)群的分布[40]。本研究中，pH 與細(xì)菌Simpson 指數(shù)，門(mén)和屬水平上的綠彎菌門(mén)、Rhizomicrobium屬和假雙頭斧形菌屬的豐度以及OTU36（變形菌門(mén)）、OTU28（放線菌門(mén)）等4 個(gè)OTUs 的豐度呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），表明pH 顯著影響了龍脊稻作梯田土壤細(xì)菌群落組成和豐度。龍脊梯田地處溫暖濕潤(rùn)的亞熱帶地區(qū)，水分長(zhǎng)期在巖石裂隙中移動(dòng)，對(duì)堿土金屬有較強(qiáng)的淋濾作用，促使土壤酸化，使pH 降低；同時(shí)，淋濾作用促進(jìn)土壤黏化，改變土壤物理性質(zhì)，使土壤蓄水保水能力增強(qiáng)，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期耕作，形成水稻土[41]，為這些細(xì)菌創(chuàng)造了適宜生存的穩(wěn)定條件。另外，海拔高度變化對(duì)優(yōu)勢(shì)物種具有一定的影響[42]，本研究中，ALS 與優(yōu)勢(shì)屬鞘氨醇單胞菌屬、優(yōu)勢(shì)OTUs中OTU1（鞘氨醇單胞菌屬）等3 個(gè)OTUs 的豐度呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明海拔高度變化影響了龍脊稻作梯田的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)；AN 與OTU20（綠彎菌門(mén)）等4 個(gè)優(yōu)勢(shì)OTUs 的豐度呈顯著正相關(guān)。在本研究中，綠彎菌門(mén)為次優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，這個(gè)門(mén)的細(xì)菌在廣西的石灰土[16]和太湖地區(qū)的黃泥土[43]中均為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，是進(jìn)行光合作用的自養(yǎng)微生物，具有固碳作用，因此可使土壤氮轉(zhuǎn)化消耗減少，促進(jìn)堿解氮含量提升[44]。土壤C/N 是土壤質(zhì)量的重要反映，在本研究中，C/N 與芽單胞菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、浮霉菌門(mén)、鏈球菌屬的細(xì)菌和OTU25等5 個(gè)OTUs 的豐度呈極顯著正相關(guān)。研究表明，芽單胞菌主要進(jìn)行碳氮的固定[45]，能夠?qū)⒏鞣N糖分子轉(zhuǎn)化為碳化合物[46]，維持土壤中碳含量水平的穩(wěn)定，同時(shí)土壤養(yǎng)分中的碳氮含量也顯著影響芽單胞菌的豐度。表明稻作梯田較高的土壤有機(jī)碳水平和碳氮養(yǎng)分的相對(duì)平衡，為土壤細(xì)菌提供了充足的碳氮養(yǎng)分供應(yīng)，促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)，提高土壤微生物多樣性[47-48]。

3.2 龍脊稻作梯田細(xì)菌功能類(lèi)群與土壤因子的關(guān)系

土壤細(xì)菌是土壤微生物中群落關(guān)系與功能最復(fù)雜多樣的生物，土壤環(huán)境微小變化可使土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生顯著變化，同時(shí)這種變化能夠反作用于環(huán)境[37]。反硝化過(guò)程會(huì)將NO-3還原成N2，不僅會(huì)造成氮損失，還會(huì)產(chǎn)生具有溫室效應(yīng)的中間產(chǎn)物N2O[49]。在本研究中，AN 與反硝化功能類(lèi)群的豐度呈顯著負(fù)相關(guān)，C/N 與反硝化功能類(lèi)群的豐度呈正相關(guān)，說(shuō)明提高氮素的可利用性可以降低由反硝化造成的氮損失[50]，可能是由于細(xì)菌將獲得的氮素快速合成為新陳代謝所需要的酶，提高自身的生存競(jìng)爭(zhēng)力。屬水平和優(yōu)勢(shì)OTUs中的羅思河小桿菌和慢生根瘤菌都可參與反硝化過(guò)程，前者能在低pH 時(shí)進(jìn)行反硝化作用，后者在稻田中對(duì)N2O 釋放有貢獻(xiàn)[51]，因此可通過(guò)適當(dāng)提高土壤pH 來(lái)抑制反硝化功能類(lèi)群的豐度，減少溫室氣體的產(chǎn)生。另外，ALS 與硫呼吸類(lèi)細(xì)菌、硫酸鹽呼吸類(lèi)細(xì)菌和硫化合物呼吸類(lèi)細(xì)菌功能類(lèi)群豐度呈顯著正相關(guān)，這三類(lèi)功能菌在OTUs 水平上包括了屬于硫酸鹽還原菌類(lèi)的脫硫弧菌屬、脫硫桿菌屬、互營(yíng)桿菌屬和硫還原菌屬等。由于微生物在驅(qū)動(dòng)硫化合物的氧化還原過(guò)程中也與其他元素（碳、氮和磷等）循環(huán)耦合[52]，因此海拔可能和土壤碳氮磷等養(yǎng)分共同影響土壤細(xì)菌硫循環(huán)功能類(lèi)群的豐度。

烴類(lèi)物質(zhì)在土壤中的積累，會(huì)改變土壤有機(jī)質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)[53]，而農(nóng)藥污染是烴類(lèi)物質(zhì)進(jìn)入土壤的重要來(lái)源[54]。在本研究中，環(huán)境因子C/N 和pH 均與烴類(lèi)降解類(lèi)功能菌顯著正相關(guān)，表明土壤中C/N 和pH升高能夠提高烴類(lèi)降解功能菌的豐度。微生物降解烴類(lèi)物質(zhì)效率高、對(duì)環(huán)境友好，是修復(fù)烴類(lèi)污染的最佳選擇[53]。本研究中，烴類(lèi)降解功能類(lèi)群中的優(yōu)勢(shì)屬鞘氨醇單胞菌屬，對(duì)芳香族化合物具有極強(qiáng)的降解能力[55-56]。羅思河小桿菌屬對(duì)難降解的氯化芳族化合物（如林丹）和各種芳族化合物也具有潛在降解能力[57-58]。假單胞菌屬對(duì)農(nóng)藥、石油烴類(lèi)都具有良好的降解效果[53]。因此提高土壤有機(jī)碳的含量，可以提高C/N，為細(xì)菌提供更多的可利用碳源，提高烴類(lèi)降解功能類(lèi)群豐度，從而降低農(nóng)藥的殘留。龍脊梯田土壤pH 偏酸性，較低的pH 不利于烴類(lèi)降解功能菌類(lèi)群豐度的提高，因此，通過(guò)改良土壤等方法提高土壤pH可以提高烴類(lèi)降解功能菌類(lèi)群的豐度和多樣性，加快農(nóng)藥降解速率。

4 結(jié)論

（1）龍脊稻作梯田土壤細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)門(mén)為變形菌門(mén)和綠彎菌門(mén)，優(yōu)勢(shì)屬為鞘氨醇單胞菌屬和羅思河小桿菌屬，土壤pH、碳氮比、海拔和堿解氮是顯著影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的環(huán)境因子。

（2）龍脊稻作梯田土壤細(xì)菌的功能類(lèi)群有51 個(gè)，受環(huán)境因子影響的主要功能類(lèi)群為反硝化類(lèi)、硫呼吸類(lèi)和烴降解類(lèi)功能類(lèi)群，主要的環(huán)境因子為pH、碳氮比、海拔和堿解氮。