梨小食心蟲細(xì)胞色素P450 CYP6AE123 基因的克隆及表達(dá)分析

韓 慧，王彪龍，李 恩，胡 軍，馬瑞燕，高玲玲，郭艷瓊

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山西太谷030801；2.澳大利亞聯(lián)邦科學(xué)與工業(yè)研究組織農(nóng)業(yè)與食品部，文布利西澳6913）

梨小食心蟲Grapholita molesta（Busck）屬鱗翅目卷蛾科小食心蟲屬，在全世界廣泛分布，主要為害桃、梨等經(jīng)濟(jì)作物，導(dǎo)致果品產(chǎn)量和質(zhì)量嚴(yán)重下降[1-6]。目前，常用的防治手段為化學(xué)防治，但長時(shí)間的不合理用藥導(dǎo)致梨小食心蟲對(duì)某些殺蟲劑敏感度降低[7]。已有不少研究表明，細(xì)胞色素P450 在昆蟲對(duì)殺蟲劑的代謝中起著非常重要的作用。

細(xì)胞色素P450（Cytochrome P450，CYP）是一類能夠代謝昆蟲內(nèi)源化合物（如激素等）和外源性化合物（如植物次生物質(zhì)、殺蟲劑等）的酶系，在昆蟲的解毒、細(xì)胞代謝和平衡中起著關(guān)鍵作用[8]。CYP 酶的誘導(dǎo)或抑制是昆蟲與藥物相互作用的基礎(chǔ)，它可以使昆蟲產(chǎn)生拒食、趨避、中毒等癥狀。細(xì)胞色素P450 具有多個(gè)進(jìn)化支，包括CYP2、CYP3、CYP4 以及線粒體CYP 簇[9]，其中CYP3 簇最大，包含CYP6、CYP9 家族在內(nèi)的多個(gè)家族。CYP6 家族屬于昆蟲特有的家族，不少研究證明，該家族基因參與外源物質(zhì)的代謝。例如飛蝗CYP6 家族參與了外源殺蟲劑的代謝[10]，其中CYP6HC1與CYP6HCL1在氨基甲酸酯類和擬除蟲菊酯類殺蟲劑代謝中起關(guān)鍵性作用[8]；岡比亞按蚊CYP6M2基因可對(duì)多種不同類別的殺蟲劑產(chǎn)生耐藥性[11]。此外，目前常用的殺蟲劑有阿維菌素、吡蟲啉以及高效氯氟氰菊酯等。其中，阿維菌素因其殺蟲效果好、對(duì)人畜毒性低等優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用于梨小食心蟲的防治[12]。

本研究從前期構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST 檢索，獲得一個(gè)細(xì)胞色素P450 基因序列。通過克隆獲得cDNA 全長序列，提交P450 國際命名委員會(huì)命名為CYP6AE123，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析和基因表達(dá)模式分析，以明確其不同發(fā)育階段和不同組織部位的表達(dá)特性，及其對(duì)不同濃度阿維菌素的響應(yīng)，為進(jìn)一步研究其功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用梨小食心蟲采自山西省晉中市太谷區(qū)西山底桃園，飼養(yǎng)于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全與生物防治研究基地人工培養(yǎng)箱中（MGC-450HP），經(jīng)室內(nèi)人工飼養(yǎng)50 代以上，光周期15 L∶9 D，相對(duì)濕度70%～80%；幼蟲飼喂人工飼料，成蟲飼喂10%蜂蜜水[13]，期間未接觸任何殺蟲劑。

收集梨小食心蟲不同發(fā)育階段樣品，成蟲3 頭、蛹5 頭、五齡幼蟲5 頭、四齡幼蟲5 頭、三齡幼蟲10 頭、二齡幼蟲30 頭、一齡幼蟲50 頭以及卵100 粒[14]。不同組織選取羽化30 h 之內(nèi)的健康梨小食心蟲成蟲，分別取頭、前腸、中腸、后腸、脂肪體、馬氏管、精巢、卵巢[15]，每個(gè)重復(fù)取60 頭成蟲。采用阿維菌素LC1（019.82 μg/mL）、LC3（072.90 μg/mL）、LC5（0179.66 μg/mL）分別處理健康的梨小食心蟲成蟲，24 h 后收集存活的成蟲樣品。以上材料均放置于液氮中速凍，存于-80 ℃冰箱中備用，以上樣品均設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 梨小食心蟲CYP6AE123 克隆

以云杉卷葉蛾CYP6AE83基因?yàn)閰⒖夹蛄校瑢?duì)梨小食心蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)檢索、BLAST 比對(duì)，獲得P450 基因的全長cDNA 序列。利用Primer Preimer 5.0 設(shè)計(jì)特異性引物（表1）。

根據(jù)RNAisoTMPlus 試劑盒說明書提取成蟲總RNA，并取1 μg 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，作為PCR 擴(kuò)增的模板。PCR 反應(yīng)體系（50 μL）：5×TransStartRFast Pfu Buffer 10 μL、2.5 mmol/L dNTPs 4 μL、上下游引物各1 μL、cDNA（1×）2 μL、TransStartRFast Pfu DNA polymerase 1 μL、ddH2O 31 μL。反應(yīng)程序：95 ℃2 min；95 ℃20 s，60 ℃20 s，72 ℃1 min，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后于紫外光下切下目的條帶回收純化。將目的基因連接至pEASY-Blunt 載體中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。將其涂布于LB 固體培養(yǎng)基中，挑取單克隆驗(yàn)證，并進(jìn)行LB 液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)。菌液驗(yàn)證后送上海生工生物有限公司測序，提交P450 命名委員會(huì)進(jìn)行命名。

表1 引物

1.3 梨小食心蟲CYP6AE123 生物信息學(xué)分析

P450基因的開放閱讀框（openreadingframe，ORF）及氨基酸序列使用ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder）預(yù)測；采用ExPASy 的在線工具Prot-Param （http://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測CYP6AE123 蛋白的理化性質(zhì)；采用SignalP 4.1 Server（http://www.cbs.dtu.-dk/services/SignalP/）分析信號(hào)肽；用NPS@_HNNsecondary[15]（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_consensus.pl）預(yù)測蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；采用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）進(jìn)行蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)同源建模。

根據(jù)NCBI BLASTX（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）的比對(duì)結(jié)果找出同源性較高的其他物種的氨基酸序列，在DNAMAN 進(jìn)行序列比對(duì)；采用MEGA 7.0 軟件并運(yùn)用鄰接法（Neighbor Joining，NJ）構(gòu)建進(jìn)化樹，抽樣次數(shù)（Bootstrap）設(shè)置1 000 次。

1.4 梨小食心蟲CYP6AE123 表達(dá)水平分析

提取不同發(fā)育階段、不同組織及不同濃度阿維菌素處理后的梨小食心蟲總RNA，并取1 μg 為模板反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以β-actin為內(nèi)參基因，RT-qPCR檢測CYP6AE123基因的相對(duì)表達(dá)量。每組樣品均設(shè)置3 次技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)體系（20 μL）：SYBR qPCR Master Mix 10 μL、10 μmol/L 的上下游引物（表1）各0.4 μL、稀釋10 倍的cDNA 模板1 μL、去離子水8.2 μL。擴(kuò)增條件為：94 ℃30 s；94 ℃10 s，50 ℃30 s，72 ℃，30 s，于72 ℃收集熒光，共40 個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT 法[16]計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（one way-ANOVA），采用Tukey 法進(jìn)行差異顯著性分析，采用Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 梨小食心蟲CYP6AE123 的克隆及序列分析

通過檢索、比對(duì)、克隆和測序，獲得梨小食心蟲細(xì)胞色素P450CYP6AE123的cDNA 全長序列（圖1），提交P450 命名委員會(huì)，命名為CYP6AE123。ORF 長度為1 524 bp，編碼507 個(gè)氨基酸；蛋白分子質(zhì)量為58 176.72 u，理論等電點(diǎn)為7.07，不穩(wěn)定指數(shù)為37.50，故該基因編碼的蛋白是穩(wěn)定的；脂肪系數(shù)為89.41，總平均親水性為-0.110，屬疏水性蛋白。二級(jí)結(jié)構(gòu)表明，CYP6AE123編碼的蛋白主要由α 螺旋（46.55 %），無規(guī)則卷曲（42.80%）以及延伸鏈（8.48 %）組成，三級(jí)結(jié)構(gòu)同源建模模擬了P450CYP6AE123的特征序列和空間結(jié)構(gòu)（圖2）。

2.2 梨小食心蟲CYP6AE123 基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

BLAST 比對(duì)結(jié)果表明，梨小食心蟲與鱗翅目昆蟲蘋果蠹蛾Cydia pomonella（Cp）、小線角木蠹蛾Streltzoviella insularis（Si）、棉鈴蟲Helicoverpa armigera（Ha） 的氨基酸序列一致性分別高達(dá)83.67%、57.39%、52.61%（表2）。

表2 梨小食心蟲CYP6AE123 的BLAST 比對(duì)

多序列比對(duì)如圖3 所示，梨小食心蟲CYP6AE123具有細(xì)胞色素P450 的特征區(qū)域，包括螺旋I、螺旋C、螺旋K、Meander 區(qū)以及血紅素結(jié)合區(qū)。

系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示（圖4），進(jìn)化樹中多為各物種的CYP6AE 家族，表明克隆得到的基因?qū)儆贑YP6AE 亞家族；且梨小食心蟲CYP6AE123與煙草天蛾CYP6AE129聚在一起，表明二者親緣關(guān)系最近，可能具有相似功能。

不同發(fā)育階段表達(dá)模式如圖5 所示，CYP6AE123在梨小食心蟲所有發(fā)育階段均有表達(dá)，成蟲期和五齡幼蟲相對(duì)較高，且差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）；其他齡期表達(dá)相對(duì)較低，且各階段之間無明顯差異。其中，卵期表達(dá)量最低，成蟲期表達(dá)量是卵期的49.20 倍，五齡幼蟲時(shí)期表達(dá)量是卵期的26.92 倍。

不同組織表達(dá)結(jié)果表明，CYP6AE123在成蟲的脂肪體中表達(dá)量最高，中腸次之；前腸和精巢中表達(dá)量最低；脂肪體中CYP6AE123表達(dá)量為精巢中的8.81 倍、前腸的6.35 倍；中腸表達(dá)量是精巢的5.42 倍、前腸的3.90 倍（圖6）。

采用不同濃度的阿維菌素對(duì)梨小食心蟲成蟲進(jìn)行處理，結(jié)果表明，低濃度阿維菌素（LC10、LC30）處理后，CYP6AE123表達(dá)量較CK 降低，但二者間無顯著變化；當(dāng)濃度增加到LC50（179.66 μg/mL）時(shí)，CYP6AE123表達(dá)顯著增加，為CK 的5.80 倍，且二者間差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）（圖7）。

3 結(jié)論與討論

本研究對(duì)梨小食心蟲CYP6AE123的多序列比對(duì)結(jié)果表明，該基因的氨基酸序列與蘋果蠹蛾、小線角木蠹蛾、棉鈴蟲的氨基酸序列一致性分別高達(dá)83.67%、57.39%、52.61%，且均有細(xì)胞色素P450 的保守區(qū)域，這些保守區(qū)域常被用作鑒定P450 的主要特征[17]。

本研究為了進(jìn)一步研究CYP6AE123的分子特性和生物功能，對(duì)不同發(fā)育階段與不同組織中CYP6AE123的表達(dá)水平進(jìn)行了表達(dá)模式研究，結(jié)果顯示，梨小食心蟲CYP6AE123在成蟲期和五齡幼蟲期表達(dá)量較高，因?yàn)槌上x期是梨小食心蟲為數(shù)不多暴露于環(huán)境中的時(shí)期，也是農(nóng)民防治的關(guān)鍵期[18]，在這個(gè)發(fā)育階段CYP6AE123基因表達(dá)量上調(diào)，相似的結(jié)果在斜紋夜蛾中也有體現(xiàn)[19]。不同組織中基因表達(dá)量顯示，CYP6AE123基因在脂肪體中表達(dá)量最高，中腸次之，可能是因?yàn)橹倔w主要用于儲(chǔ)存能量以及對(duì)外源有毒物質(zhì)的代謝[20]，而中腸是昆蟲的消化器官，暗示該基因可能與梨小食心蟲外源物質(zhì)代謝有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，殺蟲劑對(duì)昆蟲的誘導(dǎo)表達(dá)與基因代謝外源物質(zhì)密切相關(guān)。例如，在氯蟲苯甲酰胺處理甜菜夜蛾后，CYP9 家族基因被誘導(dǎo)，進(jìn)一步驗(yàn)證Unigene0035508 基因參與代謝氯蟲苯甲酰胺[21]；蘋果黃蚜細(xì)胞色素P450 基因AcCYP6CY14表達(dá)可增強(qiáng)吡蟲啉抗性[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，高濃度阿維菌素（179.66 μg/mL）誘導(dǎo)梨小食心蟲CYP6AE123表達(dá)，但該基因是否參與梨小食心蟲對(duì)阿維菌素的代謝尚不明確，下一步將對(duì)其進(jìn)行RNAi，進(jìn)一步明確其功能。

本研究克隆了梨小食心蟲CYP6 家族基因CYP6AE123，該基因?qū)儆贑YP6AE 亞家族，且包含細(xì)胞色素P450 的識(shí)別特征；表達(dá)分析研究表明，CYP6AE123在成蟲期和脂肪體高表達(dá)，且被高濃度的阿維菌素誘導(dǎo)表達(dá)，推測其可能參與梨小食心蟲對(duì)阿維菌素的代謝，研究結(jié)果可為進(jìn)一步探究梨小食心蟲CYP6AE123基因的功能奠定基礎(chǔ)。