耐鉬細(xì)菌選育馴化技術(shù)研究

程 浩，孟運(yùn)生，劉 輝，周 磊，師留印，張靜敏

(核工業(yè)北京化工冶金研究院，北京 101149)

中國(guó)火山巖型鈾礦石儲(chǔ)量較大，約占全國(guó)總儲(chǔ)量的20%以上，其中相當(dāng)部分為鈾鉬礦、鈾鉬金銀礦[1]，開發(fā)利用這類鈾礦資源具有很強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)意義。在鈾鉬共生礦中，鈾礦物以瀝青鈾礦為主；鉬礦物以輝鉬礦、膠硫鉬礦為主。

近年來鉬及其化合物的應(yīng)用領(lǐng)域不斷拓寬，鉬的需求量不斷上升，鉬的濕法浸出研究也倍受重視。具有工業(yè)價(jià)值的鉬礦物主要是輝鉬礦(MoS2)，它占國(guó)內(nèi)外開采鉬量的98%左右。輝鉬礦型鈾礦屬于難浸礦石，常規(guī)浸出方法是將礦石破磨到-250 μm(-60目)后，加入氧化劑進(jìn)行酸浸或高壓堿浸，其工藝流程復(fù)雜，試劑消耗量大，生產(chǎn)成本高。

近年來微生物濕法冶金技術(shù)在加工稀貴金屬的硫化物礦石上取得了較大進(jìn)展，硫化銅礦細(xì)菌浸出技術(shù)、難處理金礦的細(xì)菌氧化預(yù)處理技術(shù)等在國(guó)內(nèi)外都已產(chǎn)業(yè)化[2]，鈾礦細(xì)菌浸出在國(guó)外也已經(jīng)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用[3]。核化冶院經(jīng)過多年的研究，也于2002年首次實(shí)現(xiàn)鈾礦細(xì)菌堆浸工業(yè)化[4]。對(duì)于難浸的鈾鉬共生礦，尚未見細(xì)菌浸出方面的研究報(bào)道，對(duì)于輝鉬礦細(xì)菌浸出工藝研究也相對(duì)較少。

采用細(xì)菌浸出工藝處理輝鉬礦是依靠細(xì)菌的作用，完成對(duì)金屬硫化礦的氧化，解除硫化礦物對(duì)鈾、鉬等有價(jià)金屬的包裹，打通基質(zhì)粒間、微裂隙通道，方便浸出劑的進(jìn)入和浸出液的滲出，從而提高鈾、鉬、銅、鋅、鎳等有價(jià)金屬的浸出率，提高資源利用率[5]。采用氧化亞鐵硫桿菌(T.f)來氧化輝鉬礦(MoS2)是可行的[6]；但現(xiàn)有菌種對(duì)輝鉬礦(MoS2)氧化效率低，對(duì)Mo的耐受性能低[7]，從而導(dǎo)致浸出時(shí)間長(zhǎng)，鉬浸出率低。因此進(jìn)行新菌株耐鉬選育的研究，對(duì)優(yōu)化鉬礦細(xì)菌浸出過程，降低生產(chǎn)成本，提高資源綜合回收利用率都具有重要的意義。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

主要儀器：PHS-3B型精密pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；生物顯微鏡(上海精密儀器儀表有限公司)；真空泵(沈陽(yáng)市真空泵廠)；微孔濾膜(北京黎明膜分離技術(shù)有限責(zé)任公司)；WFZUV-2000型分光光度計(jì)(上海尤尼柯儀器有限公司)；BS210S型電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)；OLYMPUS BX51型系統(tǒng)顯微鏡(日本奧林巴斯株式會(huì)社)；溫度梯度PCR擴(kuò)增儀(德國(guó)Eppendorf公司)；凝膠成像系統(tǒng)(英國(guó)Syngene公司)；紫外投射反射分析儀(上?？等A生化儀器制造廠)；DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠)；三角瓶、燒杯、試管、培養(yǎng)皿(博美玻璃儀器廠)。

主要試劑包括硫酸、硫酸亞鐵、氯化鈉、瓊脂粉、硫酸銨、氯化鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鎂，均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 試驗(yàn)菌種

試驗(yàn)菌種包括原氧化亞鐵硫桿菌、氧化亞鐵鉤端螺旋菌和野生菌LM1。

氧化亞鐵硫桿菌為革蘭氏陰性無(wú)機(jī)化能自養(yǎng)菌。該菌好氧嗜酸，以Fe2+和還原態(tài)硫?yàn)槟茉次镔|(zhì)，可以氧化Fe2+、元素硫及幾乎所有的硫化礦物，能有效分解黃鐵礦。它以空氣中的CO2為碳源，吸收N、P、K等無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)，合成菌體細(xì)胞，在金屬硫化礦或煤礦的酸性礦坑水中較為常見。該菌形狀呈圓端短柄狀，細(xì)胞直徑約0.5～0.8 μm，長(zhǎng)度約1.0～1.5 μm，端生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)；適宜生長(zhǎng)pH為1～4(最佳生長(zhǎng)pH為1.8～2.5)，存活溫度為2～40 ℃(最佳存活溫度為30～35 ℃)。

氧化亞鐵鉤端螺旋菌(L.f)購(gòu)于美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所(ATCC)，該菌為專性好氧、無(wú)機(jī)化能自養(yǎng)菌。它以鐵和黃鐵礦為能源物質(zhì)，呈螺旋狀，細(xì)胞直徑約0.2～0.4 μm，長(zhǎng)度約0.9～1.1 μm，典型革蘭氏陰性菌，單鞭毛，可動(dòng)；適宜生長(zhǎng)pH為1.5～4.0(最佳生長(zhǎng)pH為1.8～2.5)，存活溫度為5～40 ℃(最佳存活溫度為28～32 ℃)。

野生菌LM1是從河南欒川鉬礦的礦坑水中分離純化而來。使用富集培養(yǎng)基對(duì)該礦坑水樣品進(jìn)行富集培養(yǎng)，將培養(yǎng)得到的野生菌通過涂布法接種到固體培養(yǎng)基中，再?gòu)墓腆w培養(yǎng)基產(chǎn)生的單獨(dú)菌落中挑取細(xì)菌接種至液體9K培養(yǎng)基中培養(yǎng)；如此往復(fù)進(jìn)行，通過固液交替培養(yǎng)方法純化得到菌株LM1。

1.3 培養(yǎng)基配方

液體9K培養(yǎng)基：在1 000 mL蒸餾水中加入3.0 g (NH4)2SO4、0.5 g K2HPO4、0.1 g KCl、1.0 g MgSO4·7H2O、44.4 g FeSO4·7H2O，混合均勻，并在121 ℃下滅菌20 min。液體9K培養(yǎng)基的pH=2.0。

固體培養(yǎng)基：在1 000 mL蒸餾水中加入5.0 g (NH4)2SO4、0.15 g KCl、0.75 g MgSO4·7H2O、2.0 g FeSO4·7H2O、10 g瓊脂，混合均勻，并在115 ℃下滅菌30 min。固體培養(yǎng)基的pH=4.6～4.8。

富集培養(yǎng)基：2倍濃度的液體9K培養(yǎng)基。

1.4 細(xì)菌耐鉬馴化試驗(yàn)方法

細(xì)菌浸礦技術(shù)中常用的無(wú)機(jī)化能自養(yǎng)菌的選育技術(shù)有馴化育種和遺傳選育[8]。馴化育種是在人為逐漸改變外界環(huán)境條件的情況下，對(duì)細(xì)菌進(jìn)行轉(zhuǎn)移培養(yǎng)，通過細(xì)菌本身優(yōu)勝劣汰的過程演變，使那些活性較強(qiáng)并逐漸發(fā)生變異的細(xì)菌存活下來，最終培育出適應(yīng)性、耐受性較強(qiáng)的新菌株[9]。

本研究采用的馴化方法為濃度梯度馴化法，即在菌株轉(zhuǎn)移培養(yǎng)的過程中逐步提高培養(yǎng)基中的鉬濃度，篩選出耐受性強(qiáng)的菌株，從而達(dá)到對(duì)試驗(yàn)菌鉬耐受性馴化的目的。

1.4.1 氧化亞鐵硫桿菌耐鉬馴化

往9K培養(yǎng)基中加入鉬酸銨，在pH 1.7～2.2、溫度28～35 ℃(用加熱棒控制溫度)條件下鼓氣培養(yǎng)，監(jiān)測(cè)培養(yǎng)物氧化還原電位大于500 mV時(shí)，將一半菌液用微孔濾膜(孔徑為0.22 μm)過濾。過濾后細(xì)菌截留在濾膜上，用蒸餾水將其沖洗入剩余培養(yǎng)基中，補(bǔ)充9K培養(yǎng)基和鉬酸銨，提高培養(yǎng)基中的鉬濃度，繼續(xù)馴化培養(yǎng)。不斷重復(fù)上述操作，逐步提高細(xì)菌對(duì)鉬的耐受能力。

1.4.2L.f菌和野生菌耐鉬馴化

在500 mL的三角瓶中加入9K培養(yǎng)基再加入鉬酸銨，控制ρ(Mo)由低到高逐漸增加進(jìn)行馴化培養(yǎng)，首先在ρ(Mo)為100 mg/L的9K培養(yǎng)基中接種20%(體積分?jǐn)?shù))的菌種，在生物培養(yǎng)箱中鼓氣培養(yǎng)(30 ℃，150 r/min)；當(dāng)培養(yǎng)基中的電位大于500 mV時(shí)，作為新的菌種再接種到ρ(Mo)更高的9K培養(yǎng)基中，再次馴化培養(yǎng)，接種量一般為培養(yǎng)基體積的10%。這樣依次不斷增加ρ(Mo)進(jìn)行耐鉬馴化。

2 馴化試驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 氧化亞鐵硫桿菌馴化結(jié)果

經(jīng)過一年馴化，氧化亞鐵硫桿菌耐鉬濃度達(dá)到550 mg/L；次年繼續(xù)對(duì)其進(jìn)行馴化，試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 氧化亞鐵硫桿菌耐鉬馴化試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)過342 d的馴化，氧化亞鐵硫桿菌的耐鉬質(zhì)量濃度從560 mg/L升高到了820 mg/L。由于鉬對(duì)氧化亞鐵硫桿菌有較強(qiáng)的毒害作用，在馴化培養(yǎng)過程中，一定要注意鉬濃度的增長(zhǎng)梯度。本馴化試驗(yàn)鉬質(zhì)量濃度每次增長(zhǎng)10～20 mg/L，每個(gè)濃度重復(fù)馴化2～3次，使細(xì)菌充分適應(yīng)溶液環(huán)境；隨著重復(fù)馴化次數(shù)的增加，細(xì)菌的培養(yǎng)時(shí)間相應(yīng)縮短。

2.2 L.f菌和野生菌的耐鉬馴化結(jié)果

經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接馴化，氧化亞鐵鉤端螺旋菌和野生菌株LM1的耐鉬濃度均得到提高，耐鉬馴化結(jié)果見表2～3。

表2 L.f菌耐鉬馴化試驗(yàn)結(jié)果

表3 野生菌株LM1耐鉬馴化試驗(yàn)結(jié)果

由表2～3可看出，L.f菌經(jīng)過145 d馴化，其耐受鉬濃度從100 mg/L升高到了620 mg/L；野生菌株LM1經(jīng)過148 d馴化，其耐受鉬濃度從100 mg/L升高到了580 mg/L。而氧化亞鐵硫桿菌經(jīng)過一年馴化耐受鉬濃度達(dá)到550 mg/L，這表明L.f菌和野生菌株LM1對(duì)耐鉬馴化的適應(yīng)性強(qiáng)于氧化亞鐵硫桿菌。試驗(yàn)表明，當(dāng)某一濃度下馴化周期較長(zhǎng)時(shí)，可通過在同一濃度梯度下反復(fù)馴化或降低濃度梯度的方法縮短馴化周期。

3 野生菌株的生理生化特性研究及分子生物學(xué)鑒定

3.1 菌落及菌體形態(tài)

菌株LM1在固體培養(yǎng)基平板上菌落較小，呈半透明，圓形，中間凸起，直徑約15～20 μm(圖1)。光學(xué)顯微鏡下觀察LM1菌體，可見菌體較小，桿狀，能運(yùn)動(dòng)；革蘭氏染色陰性，菌體呈紅色(圖2)。在透射電子顯微鏡下觀察菌體，可見有單根鞭毛，近端生，細(xì)胞直徑約0.4～0.6 μm，長(zhǎng)度約2～2.5 μm(圖3)。

圖1 LM1菌落形態(tài)

圖2 LM1革蘭氏染色結(jié)果

圖3 LM1透射電鏡照片

3.2 LM1生長(zhǎng)曲線

按培養(yǎng)基體積10%的量接種菌株于滅菌9K培養(yǎng)基中，在28 ℃搖床恒溫培養(yǎng)，做3組平行試驗(yàn)，在培養(yǎng)一定時(shí)間后取樣測(cè)OD420(420 nm波長(zhǎng)下樣品吸光度)，用未接種的9K培養(yǎng)基作為對(duì)照。LM1生長(zhǎng)曲線如圖4所示。可以看出，LM1在28 ℃下?lián)u床培養(yǎng)，在20～30 h快速生長(zhǎng)，30 h后達(dá)到穩(wěn)定期。

圖4 LM1生長(zhǎng)曲線

3.3 LM1最適培養(yǎng)條件

3.3.1 LM1生長(zhǎng)溫度

按培養(yǎng)基體積10%的量接種純化菌株于滅菌9K培養(yǎng)基中，在搖床中恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度分別是25 ℃、28 ℃、30 ℃、37 ℃，每個(gè)溫度做5組平行試驗(yàn)，48 h后測(cè)OD420，用未接種的9K培養(yǎng)基作為對(duì)照。LM1生長(zhǎng)溫度曲線如圖5所示?？梢钥闯?，30 ℃為L(zhǎng)M1最適生長(zhǎng)溫度，低于30 ℃的培養(yǎng)溫度對(duì)LM1生長(zhǎng)顯著抑制；高于30 ℃的培養(yǎng)溫度，菌體生長(zhǎng)也受到抑制。

圖5 LM1生長(zhǎng)溫度曲線

3.3.2 LM1生長(zhǎng)pH

按培養(yǎng)基體積10%的量接種菌株于滅菌9K培養(yǎng)基中，在30 ℃搖床恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)基pH分別是0.0、1.0、2.0、3.0，每個(gè)pH條件做5組平行試驗(yàn)，48 h后測(cè)OD420，用未接種的9K培養(yǎng)基作為對(duì)照。LM1生長(zhǎng)pH曲線如圖6所示?？梢钥闯?，LM1最適生長(zhǎng)pH為2.0～2.5；pH<1，菌體不生長(zhǎng)；pH>2.5，菌體生長(zhǎng)受到抑制。

圖6 LM1生長(zhǎng)pH曲線

3.3.3 LM1能源利用情況

在不含F(xiàn)e2+的100 mL 9K液體培養(yǎng)基中分別加入1%的單質(zhì)硫、4.31%的FeSO4·7H2O、4.31%的FeSO4·7H2O+1%的單質(zhì)硫、1%的Na2S2O3·5H2O；其中Na2S2O3·5H2O、FeSO4·7H2O均采用0.22 μm超濾膜過濾除菌后再加入培養(yǎng)基，單質(zhì)硫隔水蒸煮1 h后再加入培養(yǎng)基。按培養(yǎng)基體積1%的量接種，30 ℃下?lián)u床培養(yǎng)3 d后測(cè)OD420，用各組未接種的培養(yǎng)基作為對(duì)照。LM1能源利用情況如圖7所示。可以看出，LM1不能以Na2S2O3為唯一能源生長(zhǎng)，在以S為唯一能源時(shí)生長(zhǎng)微弱，在含F(xiàn)e2+的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)旺盛。

圖7 LM1能源利用情況

3.4 LM1菌株16S rDNA鑒定

采用TianGen細(xì)菌基因組提取試劑盒提取基因組DNA。PCR擴(kuò)增采用細(xì)菌16S rDNA通用引物27f(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1541r (5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’)。PCR反應(yīng)體系(50 μL)組成：MgCl2(1.5 mmol/L)、基因組DNA (10 ng)、dNTP (200 μmol/L)、引物(0.4 μmol/L)和Taq DNA聚合酶(1.25 U)。PCR反應(yīng)條件：94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，共30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物純化后連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α。

PCR擴(kuò)增獲得了LM1的16S rDNA核苷酸片斷，大小為1 526 bp，并獲得其核苷酸序列。重組質(zhì)粒由上海生工完成測(cè)序，將所得16S rDNA序列在http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi進(jìn)行N Blast，選出相似性大于98%的部分序列，進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析[10]。通過序列相似性比對(duì)和進(jìn)化樹關(guān)系比對(duì)，可得出該菌為氧化亞鐵硫桿菌(AcidithiobacillusferrooxidansLM1)。

4 結(jié)論

通過馴化可以有效提高細(xì)菌對(duì)鉬的耐受能力，其馴化速度與菌株本身性質(zhì)有關(guān)。當(dāng)馴化周期較長(zhǎng)時(shí)，可通過在同一濃度梯度下重復(fù)馴化或降低濃度梯度的方式縮短馴化周期。氧化亞鐵硫桿菌通過365 d馴化，其耐受鉬質(zhì)量濃度達(dá)到550 mg/L；經(jīng)過707 d的馴化，其耐鉬質(zhì)量濃度達(dá)到了820 mg/L。氧化亞鐵鉤端螺旋菌通過145 d馴化，其耐受鉬質(zhì)量濃度達(dá)到620 mg/L。野生菌株LM1通過148 d馴化，其耐受鉬質(zhì)量濃度達(dá)到580 mg/L。

野生菌LM1在28 ℃下的生長(zhǎng)周期為30 h，最適生長(zhǎng)溫度為30℃，最適生長(zhǎng)pH為2.0～2.5，不能以Na2S2O3為唯一能源生長(zhǎng)，在以S為唯一能源時(shí)生長(zhǎng)微弱，在含F(xiàn)e2+的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)旺盛。野生菌LM1為革蘭氏陰性菌，菌體桿狀，近端生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)；固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)菌落小，半透明，圓形，中間凸起；分子生物學(xué)鑒定結(jié)果表明該菌株為嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(AcidithiobacillusferrooxidansLM1)。