搏動(dòng)灌注對體外循環(huán)期間血流剪切力及血管內(nèi)皮糖萼功能的影響

李冠華， 曾劍鋒，李佳妮， 彭成江， 周成斌

隨著體外循環(huán)（extracorporeal circulation， ECC）技術(shù)的成熟，心血管外科得以迅猛發(fā)展，傳統(tǒng)的ECC 灌注模式是“平流灌注”，在主動(dòng)脈阻斷后血壓波形近一直線，微循環(huán)缺乏有效灌注，使血管內(nèi)皮功能受損，最終激活全身系統(tǒng)炎癥反應(yīng)［1］。 隨著ECC技術(shù)的進(jìn)步，“搏動(dòng)灌注”逐漸得以應(yīng)用，Shepard 等指出，搏動(dòng)灌注的能量等值壓力高于平均動(dòng)脈壓，其剩余血流動(dòng)力學(xué)能量產(chǎn)生的舒張期額外勢能使微循環(huán)灌注壓大于毛細(xì)血管閉合壓，從而實(shí)現(xiàn)微循環(huán)有效灌注［2］。 研究表明，搏動(dòng)灌注減輕主動(dòng)脈弓和頸動(dòng)脈竇壓力感受器發(fā)放神經(jīng)沖動(dòng)，保護(hù)ECC 期間器官功能，并緩解全身系統(tǒng)炎癥反應(yīng)［3］。 本課題組既往研究亦證實(shí)，低頻搏動(dòng)灌注可顯著減少氧化應(yīng)激及血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)，增加一氧化氮合成，減少血管內(nèi)皮素－1 的釋放［4］。

血流剪切力（flow shear stress，F(xiàn)SS）是血流經(jīng)過血管腔時(shí)所產(chǎn)生的一個(gè)沿血流方向的摩擦力，在ECC 期間，血流方式的改變可導(dǎo)致FSS 發(fā)生變化，進(jìn)而影響血管內(nèi)皮功能［5］。 血管內(nèi)皮糖萼（vascular endothelial glycocalyx，VEG）是一種富含多糖的絨毛狀結(jié)構(gòu)，覆蓋于內(nèi)皮細(xì)胞管腔膜側(cè)，最新研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SS 的改變可導(dǎo)致VEG 的某些成分脫落，如硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）和多配體蛋白聚糖－1（syndecan－1），兩者與VEG 功能密切相關(guān)［6］。 Dek?ker 及He 等發(fā)現(xiàn)，ECC 期間syndecan－l 和HS 的水平顯著增加［7－8］，筆者推測，搏動(dòng)灌注所引起FSS 的改變可能引起外周血中syndecan－l 和HS 的含量發(fā)生變化。 本研究通過對比搏動(dòng)灌注與平流灌注在ECC 期間FSS 的影響，以及syndecan－l、HS 及趨化因子C－C 型配體2［chemokine（C－C motif） ligand，CCL2］的變化，深入探討搏動(dòng)灌注對FSS 及VEG 功能的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象 本研究得到醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)［2020 倫申第（66）號(hào)］，所有患者均簽署研究知情同意書。 挑選2019 年1 月至2019 年8 月在廣東省人民醫(yī)院ECC 下瓣膜置換手術(shù)患者40 名，隨機(jī)數(shù)字表法分為搏動(dòng)灌注組及平流灌注組，每組患者20 名。 納入標(biāo)準(zhǔn)為：年齡18 ～70 歲；心功能紐約心臟協(xié)會(huì)分級(jí)Ⅱ～Ⅲ級(jí)；左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricu?lar ejection fraction，LVEF）＞45%；左心室舒張末直徑＜65 mm。 排除標(biāo)準(zhǔn)為：二次手術(shù)患者、合并感染、凝血障礙、合并房顫、頸動(dòng)脈狹窄程度＞40%或有頸動(dòng)脈斑塊、術(shù)前肝腎功能不全。

1.2 手術(shù)及ECC 方法 患者氣管插管全身麻醉成功后，采用傳統(tǒng)胸骨正中切口，使用肝素使ECC 期間活化凝血時(shí)間維持在480 s 以上。 使用德國St?ckert S5 人工心肺機(jī)行搏動(dòng)灌注或傳統(tǒng)平流灌注，參照本研究組既往研究［4］，搏動(dòng)灌注參數(shù)設(shè)置為：搏動(dòng)頻率30 次／min、脈寬30%、基礎(chǔ)流量30%。手術(shù)中ECC 流量為50 ～100 ml／kg，中低溫30 ～32℃，主動(dòng)脈阻斷后灌注4 ∶1 含血心臟停搏液，術(shù)中維持平均動(dòng)脈壓50 ～70 mmHg，ECC 期間使用α穩(wěn)態(tài)處理酸堿平衡，如出現(xiàn)低血壓則使用去氧腎上腺素維持目標(biāo)血壓，ECC 結(jié)束后魚精蛋白中和肝素。

1.3 評(píng)估ECC 下FSS

1.3.1 血液黏滯度的測定 分別在麻醉前靜息狀態(tài)、ECC 開始、主動(dòng)脈開放前、ECC 結(jié)束后四個(gè)時(shí)間點(diǎn)記錄、測定相應(yīng)數(shù)據(jù)，均為上述時(shí)間點(diǎn)1 min 以內(nèi)瞬時(shí)狀態(tài)的測定值。 取患者動(dòng)脈血2 ml，用SA－500血液流變儀（賽科希德公司）測定血液黏滯度（η）。

1.3.2 頸動(dòng)脈血流速度及舒張末期半徑測定 根據(jù)上述時(shí)間點(diǎn)，選定左側(cè)頸動(dòng)脈竇前約1 cm 處，連接彩超線陣高頻探頭，頻率5 MHz 測定頸動(dòng)脈血流速度（V）。 同時(shí)在心電圖R 波觸發(fā)點(diǎn)測定頸動(dòng)脈舒張末期半徑（R）。 最終測量值為3 個(gè)連續(xù)心動(dòng)周期測量數(shù)值的均值。

1.3.3 FSS 測定 根據(jù)Womersley 理論的血流動(dòng)力學(xué)模型測定血管壁峰值剪切力（peak wall shear stress，PWSS）［9］。 具體測定公式如下：

此公式中η 為血液黏滯度（mPa·s）；R 為血管半徑（cm）；n 為諧波數(shù)（次／min）；N 為諧波數(shù)的最大值；u(0，ωn) 為軸向血流速度的n 階諧波分量；；J0和J1是第一類零階和一階Bessel 函數(shù)；為Womersley 值；ρ流體密度（g／cm3）；ωn ＝2nπf為圓頻率（r／s）；f為基頻（Hz）。

1.4 VEG 及炎癥標(biāo)志物的檢測 在上述4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)取已肝素化的患者動(dòng)脈血，4 000 r／min 離心15 min，根據(jù)試劑盒使用操作說明，采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）測定VEG 標(biāo)志物：syndecan－l 及HS。 在手術(shù)前及ECC結(jié)束后取患者靜脈血，采用ELISA 法測定血管炎癥標(biāo)志物CCL2。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)量資料中的連續(xù)變量和非連續(xù)變量分別使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）、中位數(shù)和四分位數(shù)間距［Q（Q1，Q3）］表示；計(jì)數(shù)資料使用數(shù)值（百分比）表示。 符合正態(tài)分布的、不同時(shí)間點(diǎn)及組別的數(shù)據(jù)使用多重比較重復(fù)測量方差分析比較；不符合正態(tài)分布的則使用Wilcoxon 檢驗(yàn)；使用Spearman秩相關(guān)分析；所有統(tǒng)計(jì)學(xué)處理均使用SPSS 18.0 軟件，P＜0.05 時(shí)表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床結(jié)果 40 例患者隨機(jī)分為平流及搏動(dòng)灌注組，兩組患者術(shù)前基線資料：年齡、性別、體重、既往史、肝腎功能指標(biāo)、手術(shù)類型（單瓣／雙瓣置換）、心功能指標(biāo)的比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；術(shù)中主動(dòng)脈阻斷時(shí)間、ECC 時(shí)間的對比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；兩組患者術(shù)后ICU 停留時(shí)間、住院時(shí)間的對比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

2.2 FSS 基于血管彩超的血管半徑、血流速度等測定值，根據(jù)Womersley 模型測定兩組患者的PWSS，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在ECC 期間，兩組患者的PWSS均進(jìn)行性下降，與平流灌注相比，搏動(dòng)灌注患者下降幅度較小，在主動(dòng)脈開放前、停機(jī)后兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，搏動(dòng)組患者的PWSS 均較平流組顯著高（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。

2.3 VEG 及炎癥標(biāo)志物 Syndecan－1 和HS 是VEG的標(biāo)志物，其濃度的上升與VEG 的損傷密切相關(guān)。與手術(shù)前靜息狀態(tài)下相比，ECC 期間兩組患者的syndecan－1 和HS 濃度均升高；與平流組相比，搏動(dòng)組患者停機(jī)后的syndecan－1 測量值顯著低（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖2A）；搏動(dòng)灌注組患者主動(dòng)脈開放前、停機(jī)后HS 測量值同樣具有顯著性差異（P＜0.01 及P＜0.05，見圖2B）。

CCL2 是血管炎癥反應(yīng)標(biāo)志物，ECC 期間，兩組患者靜脈血的CCL2 濃度較術(shù)前顯著升高（P＜0.05），在停機(jī)后，實(shí)施搏動(dòng)灌注的患者血清CCL2水平顯著降低（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖2C）。

圖1 兩組在ECC 期間PWSS 的變化

表1 基線資料、術(shù)中及術(shù)后臨床資料的比較（n＝20）

2.4 FSS 與VGA 標(biāo)志物濃度的相關(guān)性 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PWSS 與syndecan－1 呈負(fù)相關(guān)（r ＝－0.81，P＜0.01），與HS 也呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.79，P＜0.01），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以此說明，實(shí)施搏動(dòng)灌注以維持相對較高的FSS，對減少VEG 的損傷具有積極意義。

圖2 兩組在ECC 期間syndecan－1、HS及CCL2 的變化

3 討 論

眾多研究已證實(shí)，ECC 期間實(shí)施搏動(dòng)灌注具有積極意義，本研究從FSS 及VEG 的角度剖析搏動(dòng)灌注保護(hù)效應(yīng)的機(jī)制。 本研究結(jié)果證實(shí)，在ECC 期間搏動(dòng)灌注顯著減少患者PWSS 的衰減幅度；VEG 的損傷程度較輕，VEG 標(biāo)志物syndecan－1 及HS 的水平較低，血管內(nèi)皮炎癥標(biāo)志物CCL2 的表達(dá)水平亦較低；此外，PWSS 與syndecan－1 及HS 的水平呈負(fù)相關(guān)。

搏動(dòng)灌注的能量等值壓力高于平均動(dòng)脈壓，由于剩余血流動(dòng)力學(xué)能量產(chǎn)生的額外勢能使舒張期微循環(huán)的灌注壓大于毛細(xì)血管閉合壓，從而改善組織灌注［2］，本課題組既往研究中也證實(shí)了上述觀點(diǎn)［4］。FSS 是血流經(jīng)過血管內(nèi)皮時(shí)產(chǎn)生的摩擦力，在實(shí)施傳統(tǒng)ECC 時(shí)，非生理性平流灌注的峰值血流速度及PWSS 較低，F(xiàn)SS 可直接作用于VEG 上，對VEG 的合成及分布有重要影響，PWSS 的降低可抑制VEG中蛋白多糖的合成，從而促進(jìn)VEG 損傷［10］。 本研究發(fā)現(xiàn)搏動(dòng)灌注顯著減少PWSS 的衰減幅度，在恢復(fù)自主血流的并行循環(huán)期間，兩組PWSS 差異仍具有顯著性，提示搏動(dòng)灌注對PWSS 的影響可能具有延長效應(yīng)。

毫無疑問，搏動(dòng)灌注較平流灌注具有顯著的血流動(dòng)力學(xué)優(yōu)勢，然而也有少量學(xué)者認(rèn)為，搏動(dòng)灌注并不能改善患者預(yù)后，對術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率、住院死亡率等指標(biāo)無影響［11］。 筆者認(rèn)為出現(xiàn)這種差異的原因是多方面的。 首先，研究對象缺乏同質(zhì)性，對年輕、器官功能良好、常規(guī)簡單手術(shù)的患者，搏動(dòng)灌注與否對預(yù)后影響可能不大。 本研究及課題組既往研究中，納入的患者均為簡單先天性心臟病及心功能良好的簡單瓣膜疾病，盡管搏動(dòng)灌注在血流動(dòng)力學(xué)上別具優(yōu)勢，然而臨床結(jié)局無異。 其次，部分研究質(zhì)量偏低，未從能量學(xué)角度來分析搏動(dòng)灌注，造成偏倚。 此外，搏動(dòng)灌注保護(hù)效應(yīng)的具體機(jī)制尚不明確，研究相對匱乏，是制約搏動(dòng)灌注進(jìn)一步臨床推廣的“卡脖子”問題。

圖3 PWSS 與syndecan－1 及HS 的相關(guān)性分析

VEG 是血液與血管內(nèi)皮之間一層約100 ～750 nm 厚度的蛋白多糖結(jié)構(gòu)，由蛋白聚糖的核心蛋白連接帶負(fù)電荷的糖胺聚糖側(cè)鏈形成，某些核心蛋白結(jié)合在糖基磷脂酰肌醇錨或其他細(xì)胞骨架跨膜結(jié)構(gòu)域上，如syndecan 家族，而糖胺聚糖側(cè)鏈主要由HS、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸等組成，其中HS 成分占50%～90%。 因此當(dāng)VEG 損傷、應(yīng)激及重分布時(shí)，均可引起syndecan－1 及HS 的釋放［12］。 VEG 在內(nèi)皮細(xì)胞表面形成一層負(fù)電荷屏障，對維持血管內(nèi)皮的正常結(jié)構(gòu)與功能至關(guān)重要，同時(shí)，VEG 是一種力學(xué)感受器，可將FSS 的力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞內(nèi)化學(xué)信號(hào)，在FSS的作用下維持著降解與合成的動(dòng)態(tài)平衡［12］。 本研究結(jié)果證實(shí)，PWSS 與syndecan－1 及HS 的水平呈負(fù)相關(guān)，表明搏動(dòng)灌注緩解ECC 期間PWSS 的衰減，有利于維持VEG 的結(jié)構(gòu)及功能。

研究表明，ECC 可導(dǎo)致VEG 急性損傷，其病因包括：血流方式、手術(shù)應(yīng)激、植入物的影響、低溫、缺血再灌注損傷、全身炎癥反應(yīng)等。 Sangalli 等［13］發(fā)現(xiàn)，ECC 期間非生理性平流的FSS 明顯低于搏動(dòng)流，與搏動(dòng)血流相比，持續(xù)性機(jī)械平流對內(nèi)皮細(xì)胞功能的損傷顯著較高，與本研究結(jié)果大致相同。 此外，VEG 還在血管炎癥的病理生理過程扮演著重要角色，當(dāng)炎癥激活時(shí)，腫瘤壞死因子等可引起VEG 脫落，激活肥大細(xì)胞釋放組胺從而進(jìn)一步降解VEG，破壞血管內(nèi)皮屏障，引起CCL2 等趨化因子激活，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)［14］。 本課題組既往研究曾證實(shí)，搏動(dòng)灌注顯著減少氧化應(yīng)激及血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)［4］；而為進(jìn)一步探索搏動(dòng)灌注保護(hù)效應(yīng)的分子機(jī)制，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)搏動(dòng)流可下調(diào)多個(gè)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，如CCL2、CX3CR1、CD163 及TLR7 等，以CCL2 下調(diào)最為明顯［15］。 本研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)施搏動(dòng)灌注可使血管內(nèi)皮炎癥標(biāo)志物CCL2 的表達(dá)水平顯著降低，由此推斷搏動(dòng)灌注通過維護(hù)VEG 功能，從而緩解血管炎癥反應(yīng)。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)，搏動(dòng)灌注減少ECC期間FSS 的衰減，對于VEG 功能的保護(hù)及緩解血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)具有積極意義。 本研究從FSS 的角度進(jìn)一步揭示搏動(dòng)灌注保護(hù)效應(yīng)的具體機(jī)制，為搏動(dòng)灌注的進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供確切的科學(xué)依據(jù)。