新型國產(chǎn)體外膜氧合系統(tǒng)用于大動(dòng)物短期心肺輔助的模型建立

蔡黎明，劉 剛，張巧妮，高思哲，齊嘉琛，閆姝潔，吉冰洋

心肺輔助是重要的體外生命支持技術(shù)，體外膜氧合（extracorporeal membrane oxygenation，ECMO）及心室輔助在臨床中的應(yīng)用日益廣泛，這與相關(guān)技術(shù)和機(jī)械設(shè)備的發(fā)展密切相關(guān)［1］。 相關(guān)研究在近年來受到廣泛關(guān)注，但基于倫理學(xué)等問題的考慮，臨床研究仍十分受限，因此需要建立穩(wěn)定的大動(dòng)物模型來開展深入研究。 本課題組前期已成功建立外周型靜脈－動(dòng)脈體外膜氧合（veno－artery extracorporeal membrane oxygenation， V－A ECMO）大鼠模型［2］，在此基礎(chǔ)上本研究希望建立易于管理且接近臨床的外周型V－A ECMO 及清醒左心室輔助大動(dòng)物模型。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)經(jīng)阜外醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn)（0098－1／2－9／2－HX（X））。 所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均為本院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的5 ～6 月齡的健康動(dòng)物，其中家豬3 只（體重分別為：74 kg、82 kg、110 kg；均為雌性），實(shí)驗(yàn)用小型豬1 只（體重43 kg，雄性）；山羊1 只（體重78 kg，雌性）。

1.2 麻醉及術(shù)前準(zhǔn)備 豬：所有實(shí)驗(yàn)豬均禁食過夜（12 h 以上），術(shù)前4 h 禁水。 術(shù)前稱重后肌肉注射舒泰0.5 mg／kg、速眠新1 mg／kg；隨后經(jīng)耳靜脈注射2～4 mg／kg 丙泊酚，進(jìn)行麻醉誘導(dǎo)，誘導(dǎo)完成后將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物平臥位固定于手術(shù)臺上。 隨后置入導(dǎo)尿管連接尿袋（雌性動(dòng)物進(jìn)行無創(chuàng)導(dǎo)尿管導(dǎo)尿，雄性動(dòng)物采用膀胱造口術(shù)進(jìn)行有創(chuàng)導(dǎo)尿）。 所有動(dòng)物經(jīng)口氣管插管，根據(jù)動(dòng)物體重及氣道狀態(tài)選取合適型號氣管插管，根據(jù)術(shù)中動(dòng)物實(shí)際情況及血?dú)饨Y(jié)果調(diào)整呼吸機(jī)參數(shù)。 術(shù)中吸入2%～3%異氟烷維持麻醉。 山羊：實(shí)驗(yàn)羊的麻醉誘導(dǎo)過程同上，誘導(dǎo)完成后右側(cè)臥位固定于手術(shù)臺上，在完成手術(shù)操作后逐漸實(shí)現(xiàn)麻醉蘇醒，實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物處于清醒且自主活動(dòng)狀態(tài)。

1.3 外科準(zhǔn)備 豬：手術(shù)部位備皮、消毒。 完成外周監(jiān)測通路的置管后，充分游離暴露右側(cè)頸動(dòng)、靜脈后經(jīng)外周靜脈通路給予10 000 U 肝素進(jìn)行全身肝素化，活化凝血時(shí)間（activated clotting time， ACT）＞300 s 后開始直視下穿刺置管。 根據(jù)動(dòng)物體重及血管條件選擇合適型號插管，動(dòng)脈選擇16～20 Fr 插管（Edwards），靜脈選擇18～25 Fr 插管（Edwards）。 導(dǎo)絲引導(dǎo)下逐級擴(kuò)張后置入動(dòng)靜脈插管（動(dòng)脈插管置管深度8 ～10 cm，靜脈置管尖端位于右心房中部），ECMO 設(shè)備于外科操作前完成預(yù)充排氣，以上所有操作順利完成并確保無誤后將頸動(dòng)、靜脈插管與ECMO 系統(tǒng)動(dòng)靜脈端分別連接，連接過程中注意無菌操作，并避免系統(tǒng)進(jìn)氣。 連接完成后分別核對動(dòng)靜脈管路，確認(rèn)無誤后開始ECMO 轉(zhuǎn)流并調(diào)整至合適的流量，同時(shí)根據(jù)血流量設(shè)置相應(yīng)的通氣流量和氧濃度。 注意牢固固定管路及插管，避免造成插管移位或脫出。 術(shù)中注意觀察豬置管部位皮膚有無紅腫、滲血等情況。 羊：手術(shù)基本操作如上所述，麻醉狀態(tài)下左側(cè)開胸暴露心尖和降主動(dòng)脈，分別置入22 Fr 金屬直角腔靜脈插管（Medtronic），插管前經(jīng)外周靜脈通路給予10 000 U 肝素進(jìn)行全身肝素化，置管成功后充分止血并牢固固定插管避免插管脫出或移位。左心室輔助裝置完成預(yù)充排氣后與插管連接并開始轉(zhuǎn)流，隨后逐漸減停麻醉藥物，動(dòng)物蘇醒并自由活動(dòng)。

1.4 管路及設(shè)備 豬：ECMO 系統(tǒng)組成（如圖1）包括：離心泵主機(jī)及控制器（江蘇賽騰醫(yī)療科技有限公司）、離心泵（江蘇賽騰醫(yī)療科技有限公司）、管路（MEDOS）、氧合器（MEDOS）。 ECMO 系統(tǒng)預(yù)充排氣采用850 ml 生理鹽水完成無血預(yù)充。 ECMO 循環(huán)示意圖見圖2。

圖1 ECMO 系統(tǒng)組成

圖2 ECMO 循環(huán)示意圖

羊：左心室輔助系統(tǒng)組成包括：常規(guī)體外循環(huán)管路，離心泵主機(jī)及控制器（江蘇賽騰醫(yī)療科技有限公司）。 系統(tǒng)預(yù)充采用400 ml 生理鹽水實(shí)現(xiàn)無血預(yù)充。 左心室輔助循環(huán)示意圖如圖3。

圖3 左心室輔助循環(huán)示意圖

1.5 轉(zhuǎn)流過程 豬：置管前抽取動(dòng)脈血?dú)?，監(jiān)測ACT＞300 s 開始頸動(dòng)、靜脈置管，置管成功后與ECMO 系統(tǒng)連接，保證管路通暢且無氣體進(jìn)入，開始ECMO 轉(zhuǎn)流。 術(shù)中肝素泵以12～50 U／（kg·h）的速度經(jīng)外周靜脈持續(xù)泵入，維持ACT 在100 ～300 s。離心泵起始轉(zhuǎn)速為2 500 r／min、流速為1.2 L／min，術(shù)中根據(jù)動(dòng)物情況逐漸加大轉(zhuǎn)速以維持充足的器官灌注。 ECMO 系統(tǒng)氣源來自實(shí)驗(yàn)室中心氣源，通氣量為1.5 L／min，氧濃度為60%，術(shù)中根據(jù)血?dú)饨Y(jié)果進(jìn)行調(diào)整。 恒溫水箱溫度設(shè)置為36 ～38℃，術(shù)中注意維持實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體溫于36～37℃。 術(shù)中注意關(guān)注動(dòng)物尿的顏色及尿量，關(guān)注動(dòng)物容量狀態(tài)，保證出量與入量的基本平衡以維持充足的靜脈引流；術(shù)中補(bǔ)充液體原則為晶體∶膠體為1 ∶2。 ECMO 轉(zhuǎn)流時(shí)間分別如下：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物1 轉(zhuǎn)流24 h，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2 ～3 轉(zhuǎn)流48 h，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4 轉(zhuǎn)流72 h。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物5（山羊）：心尖及降主動(dòng)脈置管成功后與左心室輔助系統(tǒng)連接，保證系統(tǒng)密閉無氣體進(jìn)入。 抽取動(dòng)脈血監(jiān)測ACT＞500 s 開始轉(zhuǎn)流，術(shù)中按需經(jīng)外周靜脈補(bǔ)充肝素（由于清醒動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，未給予肝素持續(xù)泵入）。 離心泵轉(zhuǎn)速為2 495 r／min、流速1.8 L／min，術(shù)中關(guān)注動(dòng)物麻醉蘇醒及進(jìn)食水情況，牢固固定插管和機(jī)器，避免動(dòng)物活動(dòng)造成脫出，轉(zhuǎn)流時(shí)間為24 h。

1.6 數(shù)據(jù)處理 豬：每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別于術(shù)前、術(shù)中和結(jié)束前監(jiān)測血?dú)狻⒛坝坞x血紅蛋白濃度（根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具體情況作出調(diào)整），并記錄相關(guān)指標(biāo)的值。 羊：每8 h 監(jiān)測游離血紅蛋白濃度并記錄。

2 結(jié) 果

所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均順利完成實(shí)驗(yàn)，術(shù)中生命體征平穩(wěn)，過程中無動(dòng)物死亡，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后均于麻醉狀態(tài)下給予高鉀溶液處死。 各實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具體結(jié)果分別如下：

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物1 該實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為小型實(shí)驗(yàn)用豬，體重43 kg，雄性，ECMO 轉(zhuǎn)流時(shí)間為24 h。 ECMO 轉(zhuǎn)流參數(shù)見表1，該結(jié)果提示實(shí)驗(yàn)過程中機(jī)器運(yùn)轉(zhuǎn)正常，轉(zhuǎn)速與流速基本匹配；游離血紅蛋白濃度見圖4，該結(jié)果提示未見游離血紅蛋白明顯升高；血?dú)饨Y(jié)果見表2，實(shí)驗(yàn)過程中該動(dòng)物血紅蛋白濃度出現(xiàn)下降，可能存在明顯血液稀釋，其余指標(biāo)基本平穩(wěn)；凝血相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果見表3，該結(jié)果提示術(shù)中抗凝穩(wěn)定。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2 該實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為家豬，體重74 kg，雌性，ECMO 轉(zhuǎn)流時(shí)間為48 h。 ECMO 轉(zhuǎn)流參數(shù)見表1，游離血紅蛋白濃度見圖4，血?dú)饨Y(jié)果見表2，凝血相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果見表3，以上結(jié)果均未見異常，提示術(shù)中平穩(wěn)。

2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3 該實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為家豬，體重82 kg，雌性，ECMO 轉(zhuǎn)流時(shí)間為48 h。 ECMO 轉(zhuǎn)流參數(shù)見表1，游離血紅蛋白濃度見圖4，血?dú)饨Y(jié)果見表2，凝血相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果見表3，以上結(jié)果均未見異常，提示術(shù)中平穩(wěn)。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物輔助循環(huán)轉(zhuǎn)流參數(shù)

2.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4 該實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為家豬，體重110 kg，雌性，ECMO 轉(zhuǎn)流時(shí)間為72 h。 ECMO 轉(zhuǎn)流參數(shù)見表1，該結(jié)果提示跨膜壓差較大，可能存在氧合器血栓形成；游離血紅蛋白濃度見圖4，該結(jié)果提示游離血紅蛋白濃度升高，可能存在血栓形成造成血液破壞增加；血?dú)饨Y(jié)果見表2，該結(jié)果未見異常；凝血相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果見表3，該動(dòng)物術(shù)中抗凝效果欠佳。

表2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血?dú)饨Y(jié)果

表3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物凝血結(jié)果

2.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物5 （山羊） 該實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為山羊，體重78 kg，雌性。 左心室輔助轉(zhuǎn)流時(shí)間為24 h，轉(zhuǎn)流參數(shù)見表1，該結(jié)果未見異常。 游離血紅蛋白濃度見圖4，該結(jié)果未見異常。 動(dòng)物術(shù)中狀態(tài)平穩(wěn)，麻醉蘇醒狀態(tài)穩(wěn)定，可自主活動(dòng)（見圖5～6）。

圖4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物游離血紅蛋白濃度

圖5 山羊術(shù)后蘇醒支具輔助階段

圖6 山羊清醒及輔助后完全自主活動(dòng)

3 討 論

當(dāng)患者的心肺功能嚴(yán)重受損時(shí)，ECMO 作為心肺輔助的技術(shù)之一，可以代替肺的氣體交換功能和心臟的泵血功能，維持全身氧供和血流動(dòng)力學(xué)的穩(wěn)定，保障全身臟器充分有效的氧合血灌注［3－6］，使氧供與氧耗逐漸恢復(fù)平衡，從而糾正組織器官缺氧，使內(nèi)環(huán)境恢復(fù)穩(wěn)定。 V－A ECMO 在循環(huán)輔助方面的應(yīng)用給患者帶來顯著生存獲益，受到廣泛關(guān)注；左心室輔助也是有效的心臟輔助手段之一，可以有效減少左心室的做功，有利于心臟功能的恢復(fù)。 本研究著眼于探索上述兩種心肺輔助大動(dòng)物模型的建立，并就建立過程中的關(guān)鍵問題進(jìn)行討論。

3.1 外周型V－A ECMO 模型初步探索 國內(nèi)外報(bào)道的大動(dòng)物V－A ECMO 模型多是選用體重較小的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物［7－11］，因此本研究第一只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取體重43 kg 的小型豬進(jìn)行探索。 通過對該動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程總結(jié)發(fā)現(xiàn)，體重較小的動(dòng)物血容量較少且血管偏細(xì)，實(shí)驗(yàn)過程中難以保證充足的靜脈引流，大量補(bǔ)充液體會造成明顯血液稀釋；術(shù)中管理難度大，不適宜應(yīng)用于中短期V－A ECMO 模型的建立。 基于上述考慮，本研究將后續(xù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物調(diào)整為體重較大的家豬，并逐漸延長ECMO 轉(zhuǎn)流時(shí)間，以探索中短期V－A ECMO 模型的最佳動(dòng)物選擇。 最終結(jié)果提示體重在60～90 kg 的雌性家豬為中短期外周型V－A ECMO大動(dòng)物模型的最佳動(dòng)物選擇，該種動(dòng)物體重適中，插管型號和ECMO 實(shí)際運(yùn)行參數(shù)等均接近臨床中的實(shí)際應(yīng)用情況，術(shù)中引流量充足，管理難度小，模型穩(wěn)定性高。

采取股動(dòng)、靜脈的插管方式［3－7］不適用于體重較大且轉(zhuǎn)流時(shí)間較長的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，主要是由于該種插管方式下的靜脈插管長度相對偏短，難以到達(dá)實(shí)驗(yàn)豬的右心房水平，很難保證充足的靜脈引流量，進(jìn)而影響ECMO 的輔助效果。 因此本研究采用頸動(dòng)、靜脈插管方式，靜脈插管能順利置于右心房中部，在保證充足靜脈引流的同時(shí)減小了護(hù)理難度，同時(shí)采用國產(chǎn)新型便攜式設(shè)備（賽騰醫(yī)療OASSISTTMECMO系統(tǒng)，未上市）輔助完成實(shí)驗(yàn)，便于長時(shí)間心肺輔助研究的開展。

3.2 山羊清醒左心室輔助模型初步探索 基于對上述豬V－A ECMO 模型的總結(jié)，本研究嘗試進(jìn)一步探索清醒心肺輔助大動(dòng)物模型的建立。 清醒的動(dòng)物模型有利于動(dòng)物攝取食物和水，避免營養(yǎng)不足及長時(shí)間麻醉帶來的風(fēng)險(xiǎn)。 清醒的動(dòng)物模型需要選用性情溫和的動(dòng)物，避免動(dòng)物躁動(dòng)導(dǎo)致插管脫出等不良事件的發(fā)生，因此清醒的動(dòng)物模型選用山羊來完成實(shí)驗(yàn)。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中過大過多的設(shè)備對動(dòng)物的活動(dòng)限制極大，增加了清醒ECMO 的管理難度，不適宜長時(shí)間轉(zhuǎn)流，本實(shí)驗(yàn)采用便攜式設(shè)備來建立左心室輔助的清醒模型，該模型管路簡單、動(dòng)物負(fù)重小、操作難度小、易于護(hù)理、成功率及穩(wěn)定性高，適合長時(shí)間的轉(zhuǎn)流。

3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 外周型V－A ECMO 模型所涉及的4 只實(shí)驗(yàn)豬均順利完成實(shí)驗(yàn)，未出現(xiàn)動(dòng)物死亡，插管過程順利，術(shù)中生命體征平穩(wěn)，血?dú)饨Y(jié)果滿意。本實(shí)驗(yàn)選取4 只不同品系和體重的豬完成實(shí)驗(yàn)，并逐漸延長ECMO 轉(zhuǎn)流時(shí)間，用以探索適合該模型的最佳實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇。 最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)中血?dú)饨Y(jié)果平穩(wěn)，說明ECMO 過程中的通氣管理策略滿意。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物1～3 術(shù)中凝血指標(biāo)控制滿意，未見血栓形成和出血等并發(fā)癥。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4 轉(zhuǎn)流時(shí)間最長，為72 h；隨著ECMO 時(shí)間的延長，逐漸出現(xiàn)ACT 數(shù)值的下降，加大肝素劑量后無明顯改善，并且出現(xiàn)膜肺前后壓力差的明顯增加以及游離血紅蛋白濃度的升高；提示膜肺內(nèi)部阻力較大、可能有血栓形成，當(dāng)血液通過阻力較大的膜肺時(shí)，剪切應(yīng)力增加而產(chǎn)生了血液破壞，進(jìn)而造成游離血紅蛋白濃度的升高。 該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能是由于抗凝不足導(dǎo)致；也可能是長時(shí)間的抗凝造成機(jī)體凝血系統(tǒng)紊亂，且無法輸注紅細(xì)胞和血小板等血制品，最終導(dǎo)致凝血功能紊亂無法糾正；也有可能是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的個(gè)體差異導(dǎo)致。 結(jié)合4 只動(dòng)物術(shù)中情況考慮：體重較小的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物1（43 kg）難以保證充足的靜脈引流；體重過大的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4（110 kg）與臨床實(shí)際偏差較大，術(shù)中管理難度大；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2 ～3（60 ～90 kg）術(shù)中各項(xiàng)指標(biāo)平穩(wěn)、靜脈引流充足、貼合臨床實(shí)際、未出現(xiàn)不良事件。

清醒左心室輔助動(dòng)物模型選取羊完成實(shí)驗(yàn)，插管過程順利，無大量出血，術(shù)中動(dòng)物生命體征平穩(wěn)，麻醉蘇醒順利，24 h 機(jī)器運(yùn)轉(zhuǎn)正常。 清醒后動(dòng)物可自由活動(dòng)，并且能順利進(jìn)食水，未出現(xiàn)不良事件。

3.4 實(shí)驗(yàn)存在的不足 本實(shí)驗(yàn)存在的主要不足是動(dòng)物數(shù)量較少，主要原因是由于本實(shí)驗(yàn)處于對全新模型建立的探索階段，并未對具體臨床問題進(jìn)行研究，并且考慮到大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性更高，所以選取的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量較少。 本實(shí)驗(yàn)的另一個(gè)不足是在抗凝管理方面，監(jiān)測抗凝效果的指標(biāo)較少，并且對于肝素抗凝不敏感的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物未能預(yù)先備選其他抗凝方案完成實(shí)驗(yàn)；由于選取的是正常動(dòng)物且受限于實(shí)驗(yàn)條件，未能細(xì)化凝血監(jiān)測指標(biāo)，并且藥物準(zhǔn)備欠缺；由于受限于實(shí)驗(yàn)條件，無法進(jìn)行紅細(xì)胞、血小板等血液制品的輸注，導(dǎo)致凝血功能紊亂難以糾正。 本實(shí)驗(yàn)相關(guān)抗凝結(jié)果提示，后續(xù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)提前準(zhǔn)備預(yù)案，注意加強(qiáng)凝血監(jiān)測和抗凝管理，結(jié)合凝血全項(xiàng)及ACT等各項(xiàng)指標(biāo)綜合評判［12］。 關(guān)于清醒左心室輔助模型，建立過程中應(yīng)放置胸腔閉式引流，方便對實(shí)驗(yàn)過程中的出血情況進(jìn)行監(jiān)測。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用頸動(dòng)、靜脈置管的方式成功建立中短期外周型V－A ECMO 大動(dòng)物模型，該模型可行性及穩(wěn)定性高，并篩選出最佳的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為60 ～90 kg的雌性家豬。 并且在便攜式可穿戴設(shè)備的輔助下成功完成清醒左心室輔助大動(dòng)物模型的建立。