秋水仙素處理對‘紅陽’獼猴桃四倍體誘導(dǎo)的影響*

李良良，吳 迪，張懷山，王夢柳，李葦潔

（1貴州省山地資源研究所，貴陽550001）（2六盤水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院）

獼猴桃屬獼猴桃科（Actinidiaceea）獼猴桃屬（Actinidia）藤本植物，共有54個(gè)種，其中原產(chǎn)于中國的有52種[1]?！t陽’是四川省選育的品種，屬于中華獼猴桃系列，果實(shí)短圓柱形，單果重70～100 g，果皮綠色，密被腺點(diǎn)，鮮果橫剖面沿果心有紫紅色線條呈放射狀分布，色彩鮮美，果肉細(xì)嫩，果味香甜，深受消費(fèi)者喜愛[2]。獼猴桃屬植物倍性復(fù)雜多樣，目前已發(fā)現(xiàn)有二倍體到十二倍體植株的存在[3]。多倍體植株通常具有果實(shí)發(fā)育大、植株生長較為旺盛、產(chǎn)量較高、抗性較強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[4-7]?！t陽’獼猴桃因倍性是二倍體，其抗病性、抗蟲性、抗寒性不及生產(chǎn)上所用的六倍體美味獼猴桃，如何改良‘紅陽’獼猴桃品種，提高其抗性成為我國獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展急需解決的問題之一。

目前植物多倍體多采用化學(xué)方法中的秋水仙素處理[8]。秋水仙素能破壞紡錘體的形成，導(dǎo)致染色體的加倍[9]。韓禮星等[10]采用200 mg/L秋水仙素、300 mg/L 8-OH喹啉、500 mg/L對二氯苯處理獼猴桃1周左右成功得到多株嵌合體，但未見純合多倍體。蔣洪恩等[11]采用秋水仙素處理成功得到棗的四倍體植株。誘變育種能有效克服遠(yuǎn)緣雜交不親和，有效縮短育種年限，創(chuàng)造新的種質(zhì)資源[12]。多倍體育種能提高獼猴桃果實(shí)單果重、避免膨大劑的使用，而國內(nèi)外對倍性育種的研究還相對較少。劉麗等[13]用秋水仙素對‘瓊露’獼猴桃進(jìn)行處理，成功得到四倍體植株，并發(fā)現(xiàn)四倍體植株葉片變大，葉面變厚；張弛[14]以‘紅陽’獼猴桃離體組培苗為試驗(yàn)材料，用0.2%秋水仙素浸泡48 h誘導(dǎo)率為20%。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，采用秋水仙素浸泡‘紅陽’獼猴桃新萌發(fā)愈傷組織的方法進(jìn)行多倍體的誘導(dǎo)，以期能提高多倍體誘導(dǎo)率，獲得單果重大、抗性強(qiáng)、適應(yīng)性好的新種質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

前期工作已經(jīng)成功建立‘紅陽’獼猴桃快繁體系[15]，選取剛剛萌發(fā)的‘紅陽’獼猴桃愈傷組織作為試驗(yàn)材料。

1.2 多倍體的誘導(dǎo)和不定芽的再生

在超凈工作臺上取‘紅陽’獼猴桃新萌發(fā)的幼嫩愈傷組織，分別浸泡在經(jīng)過抽濾滅菌的50、100、150 mg/L的秋水仙素溶液中3、4、5、6 h[13]，以浸泡在無菌水中處理5 h作為對照。吸水紙吸干后，接種在MS+2 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂的再生培養(yǎng)基上，光照度2 500 lx、時(shí)間16 h/d、25 ℃的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)處理接種50個(gè)愈傷組織，30 d后觀察愈傷組織的成活情況。分離愈傷組織長出的不定芽，轉(zhuǎn)接到MS+1 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂的增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行多倍體的鑒定。

1.3 多倍體鑒定

取0.5 cm2的再生新梢葉片放在潔凈的培養(yǎng)皿中，加入400 mL細(xì)胞裂解液（Partec HR-A），用鋒利的刀片快速剁碎，裂解2 min，將樣品通過30 μmol Partec Celltrics TM微孔膜過濾到上樣管中，加入DAPI染色液1 600 mL（Partec HR-B）染色1 min。采用德國Partec公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用已經(jīng)得到的最佳誘導(dǎo)‘紅陽’獼猴桃四倍體植株的秋水仙素濃度和處理時(shí)間對‘紅陽’獼猴桃健康的愈傷組織100個(gè)進(jìn)行誘導(dǎo)，再將不定芽分成單株，轉(zhuǎn)接到MS+1 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂的增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行多倍體的鑒定。進(jìn)一步驗(yàn)證此配方對‘紅陽’獼猴桃愈傷組織的成活率和誘導(dǎo)率的影響，以得到更多的‘紅陽’獼猴桃四倍體和嵌合體。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙素對‘紅陽’獼猴桃愈傷組織存活率的影響

從表1可以看出，愈傷組織的存活率隨著秋水仙素濃度和處理時(shí)間的增加而逐漸降低。對照處理5 h后，愈傷組織存活率為96%；秋水仙素濃度為50 mg/L時(shí)，愈傷組織存活率由82%下降到60%；秋水仙素濃度為100 mg/L時(shí)，愈傷組織存活率由78%下降到58%；秋水仙素濃度為150 mg/L時(shí)，愈傷組織存活率由66%下降到18%?？梢?，秋水仙素處理后愈傷組織存活率均低于對照。在處理時(shí)間為3 h的條件下，秋水仙素濃度為50、100、150 mg/L時(shí)，愈傷組織存活率分別為82%、78%、66%。

表1 秋水仙素處理對愈傷組織存活率的影響

2.2 秋水仙素對‘紅陽’獼猴桃倍性及變異率的影響

采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞核的相對含量，結(jié)果表明：1株為四倍體植株（圖1-A），有1個(gè)峰值，其細(xì)胞核相對含量為200；14株為嵌合體（圖1-B），有2個(gè)峰值，其細(xì)胞核相對含量分別為100、200；對照為二倍體植株（圖1-C），有1個(gè)峰值，其細(xì)胞核相對含量為100。

圖1 不同倍性細(xì)胞核DNA的相對含量

從表2可以看出，用100 mg/L的秋水仙素浸泡‘紅陽’獼猴桃愈傷組織5 h變異率達(dá)到23.68%，其中四倍體植株1株，嵌合體8株，其余濃度秋水仙素處理均未能得到四倍體植株。通過進(jìn)一步的觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過秋水仙素處理得到的四倍體植株與對照二倍體植株有明顯的差異，與對照相比，葉片加厚、加大，葉面變得粗糙，但出現(xiàn)明顯的畸形（圖版2），生長明顯變得緩慢。

表2 秋水仙素處理對植株變異率的影響

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

前期試驗(yàn)結(jié)果顯示，用100 mg/L秋水仙素處理‘紅陽’獼猴桃愈傷組織5 h，變異率為23.68%，得到1株四倍體和8株嵌合體，變異率最高，效果最好。

在前期工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示：用100 mg/L秋水仙素浸泡愈傷組織5 h，100個(gè)愈傷組織成活69株，其余均變黑褐化死亡，其愈傷組織成活率達(dá)到69%；對成活的69株進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)，待不定芽長至2～3片幼嫩的葉片，開始分離不定芽，得到成活的不定芽共196株；采用流失細(xì)胞儀對得到的196株不定芽檢測發(fā)現(xiàn)，變異植株47株，其中有6株四倍體，其余均為嵌合體，變異率達(dá)到23.97%。6株‘紅陽’獼猴桃四倍體植株均表現(xiàn)出長勢較弱、葉片有明顯畸形，與前期誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果一致。

3 討論與結(jié)論

獼猴桃作為多年生藤本經(jīng)濟(jì)作物，育種周期較長而導(dǎo)致育種速度緩慢，目前常用的育種手段為雜交，但其隨機(jī)性比較強(qiáng)，而倍性育種目的較為明確，可較快地創(chuàng)新種質(zhì)資源，有效豐富育種材料。目前，多倍體的誘導(dǎo)多采用秋水仙素處理發(fā)芽的種子以及幼嫩的葉片等，以進(jìn)一步得到倍性變化的植株[16]。本研究對‘紅陽’獼猴桃愈傷組織進(jìn)行秋水仙素處理以誘導(dǎo)四倍體，因愈傷組織細(xì)胞分裂快、結(jié)構(gòu)更加疏松，秋水仙素能更好地和細(xì)胞進(jìn)行接觸，對細(xì)胞產(chǎn)生更好的誘導(dǎo)效果。秋水仙素誘導(dǎo)只有在合適的濃度和時(shí)間范圍內(nèi)才能成功。但秋水仙素是一種有毒制劑，周慧文等研究表明，長時(shí)間的浸泡能導(dǎo)致植株的大概率死亡[17]，與本研究的結(jié)果一致。

前人多采用染色體計(jì)數(shù)法和去壁低滲火焰干燥法統(tǒng)計(jì)植物的倍性[6]，此種方法較為繁瑣，材料浪費(fèi)現(xiàn)象比較嚴(yán)重，流式細(xì)胞儀作為一種新興的鑒定方法[18]，已經(jīng)在多種果樹上得到了驗(yàn)證和應(yīng)用，但是價(jià)格相對較為昂貴[19]。本研究以100 mg/L秋水仙素浸泡‘紅陽’獼猴桃愈傷組織5 h，得到四倍體植株只有1株，嵌合體有8株。通過驗(yàn)證試驗(yàn)進(jìn)一步表明，100 mg/L秋水仙素浸泡‘紅陽’獼猴桃愈傷組織5 h變異率達(dá)到23.97%，并得到47株變異植株，其中6株為四倍體植株，比秋水仙素直接處理組培苗莖尖的誘導(dǎo)率為20%[14]要高，這可能跟愈傷組織細(xì)胞松散與秋水仙素接觸面積更大，進(jìn)而提高了誘導(dǎo)率有關(guān)。四倍體植株與二倍體植株相比，葉片變大，葉面變厚，但是畸形較為嚴(yán)重，后續(xù)能否長出完整的植株，還需要進(jìn)一步觀察。本試驗(yàn)得到多株嵌合體，能否從嵌合體中通過葉片離體再生技術(shù)分離出同質(zhì)突變體[20]還需要進(jìn)一步研究。