麻黃加術(shù)湯治療風濕性心臟病的網(wǎng)絡藥理學機制

譚靜琳， 褚慶民， 李秋明

（1.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405；2.廣州醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院，廣東廣州 510130）

風濕性心臟?。╮heumatic heart disease，RHD）是A組溶血性鏈球菌感染所引起的自身免疫性疾病，主要累及二尖瓣，表現(xiàn)為瓣膜狹窄和關(guān)閉不全[1]。風濕性心臟病在我國仍有較高的患病率，是導致慢性心力衰竭的主要心血管疾病之一[2-3]?，F(xiàn)代醫(yī)學對風濕性心臟病的發(fā)病機制認識確切，但無法根治，需長期甚至終生服用抗生素治療，其中大部分患者仍不可避免地發(fā)展至心力衰竭階段。中醫(yī)學無風濕性心臟病病名，根據(jù)心悸、關(guān)節(jié)紅腫熱痛等主要臨床癥狀，將其歸屬于“心痹”范疇?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》提及“脈痹不已，復感于邪，內(nèi)舍于心”“心痹者，脈不通，煩則心下鼓，暴上氣而喘”。我院應用麻黃加術(shù)湯加減治療風濕性心臟病外感風寒濕證的療效甚佳。從現(xiàn)代醫(yī)學病理角度發(fā)現(xiàn)，無論是風濕性心臟病的炎性滲出階段還是肉芽形成階段，均可予麻黃加術(shù)湯辨證使用[4]。但其作用機制尚不清楚。網(wǎng)絡藥理學（network pharmacology）是基于藥理學及生物學等多學科的交叉理論，其可運用蛋白質(zhì)組學及網(wǎng)絡分析等多項前沿技術(shù)，揭示“方劑-成分-靶標-疾病”之間復雜的網(wǎng)絡關(guān)系，從多維度理解疾病的分子基礎，預測藥物的藥理學潛在機制[5]，為新藥研發(fā)或老藥新用提供新的思路。因此，本研究運用網(wǎng)絡藥理學方法，分析麻黃加術(shù)湯干預風濕性心臟病的有效藥性成分和可能的分子通路，以期為臨床用藥提供科學依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)庫與軟件來源中藥系統(tǒng)藥理學技術(shù)平臺（TCMSP）（https：//tcmspw.com/tcmsp.php/）；通用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（UniProt）（https：//www.uniprot.org/）；在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM）（http：//omim.org/）；人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards）（http：//www.genecards.org/）；生物學信息注釋數(shù)據(jù)庫（DAVID）（https：//david.ncifcrf.gov/）；STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）；OmicShare網(wǎng)站（http：//www.omicshare.com/tools）；網(wǎng)絡拓撲屬性分析軟件Cytoscape 3.7.0。

1.2中藥活性成分的收集與篩選在TCMSP數(shù)據(jù)庫中，以“麻黃”“桂枝”“苦杏仁”“甘草”“白術(shù)”為關(guān)鍵詞，檢索獲取相關(guān)中藥化學成分信息，以類藥性（drug-like，DL）≥0.18、口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%為條件對化學成分進行篩選[6]，獲取活性成分。OB代表口服藥物的活性或有效成分到達體循環(huán)并被吸收的程度和速度，OB值越高代表藥物生物活性分子的DL越好[7]。

1.3藥物作用靶標與風濕性心臟病靶標的獲取應用TCMSP數(shù)據(jù)庫中的靶標預測功能搜集上述中藥的有效化學成分的靶標蛋白，借助UniProt數(shù)據(jù)庫，通過導入蛋白名稱并限定物種為“人”，將檢索到的所有靶標蛋白校正為Official Gene Symbol，得到靶標蛋白所對應的基因名[8]。通過輸入關(guān)鍵詞“rheumatic heart disease”，在數(shù)據(jù)庫OMIM與GeneCards中收集風濕性心臟病靶標。最后將各個藥物作用靶標與疾病靶標作比對，篩出二者的共同靶標，得到麻黃加術(shù)湯對風濕性心臟病的靶標。

1.4活性成分-風濕性心臟病靶標網(wǎng)絡的構(gòu)建將麻黃、桂枝、苦杏仁、甘草、白術(shù)的活性成分與風濕性心臟病靶標上傳到Cytoscape 3.7.0軟件中，構(gòu)建藥物活性成分-風濕性心臟病靶標網(wǎng)絡。網(wǎng)絡中的節(jié)點表示靶標或化合物，而邊則表示活性成分與風濕性心臟病靶標之間的相互作用。

1.5靶標互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡的構(gòu)建在STRING數(shù)據(jù)庫中檢索麻黃加術(shù)湯和風濕性心臟病疾病的潛在靶標，物種選擇為“Homo Sapiens”，最低相互作用閾值設置為“Medium Confidence（中等置信度）”0.4[9]，其余參數(shù)作默認設置處理，獲得靶標的相互作用關(guān)系。再通過Cytoscape 3.7.0軟件制作出PPI網(wǎng)絡，使用Network Analyzer進行網(wǎng)絡分析，根據(jù)連接度調(diào)節(jié)網(wǎng)絡中節(jié)點的大小，制作出PPI網(wǎng)絡。連接度即Degree，是指PPI網(wǎng)絡里節(jié)點所通過的邊的個數(shù)。Degree值越大代表此節(jié)點與其他節(jié)點的關(guān)系更緊密，在網(wǎng)絡中地位越重要。

1.6 GO功能富集分析與KEGG通路富集分析在數(shù)據(jù)庫DAVID中導入麻黃加術(shù)湯和風濕性心臟病疾病的潛在靶標，選擇“OFFICE_GENE_SYMBOL”“Gene List”，種屬選為“Homo Sapiens”，再選取“Gene Ontology”下的“GOTERM_BP_DIRECT”以及“pathways”下的“KEGG_PATHWAY”進行GO生物過程的富集分析以及KEGG通路分析。以P<0.01且從小到大排序作為篩選條件，選取符合條件的前20位的GO生物過程及KEGG通路。再應用OmicShare云平臺，進行數(shù)據(jù)可視化處理。參考現(xiàn)有研究，篩選出與風濕性心臟病治療相關(guān)的可能通路，與藥物相應的活性成分構(gòu)建出“藥物-靶標-通路-疾病”網(wǎng)絡圖。

2 結(jié)果

2.1麻黃加術(shù)湯的藥物作用靶標預測及分析以OB≥30%、DL≥0.18為篩選條件，共篩選出針對風濕性心臟病的120個活性成分，其中，麻黃22個，桂枝6個，苦杏仁16個，甘草88個，白術(shù)4個（活性成分在藥物之間有重復），見表1（僅列舉25個）。將該活性成分的靶標輸入UniProt數(shù)據(jù)庫后獲得相同數(shù)目基因靶標，將所有的基因靶標與數(shù)據(jù)庫OMIM和GeneCards中涉及風濕性心臟病的基因進行匹配對比，最終獲得可能與風濕性心臟病有關(guān)的靶標103個。

表1 麻黃加術(shù)湯針對風濕性心臟病活性成分的基本信息Table 1 Data of active ingredients from Mahuangjiazhu Decoction for rheumatic heart disease

（續(xù)表1）

2.2麻黃加術(shù)湯活性成分-風濕性心臟病靶標網(wǎng)絡構(gòu)建圖1結(jié)果顯示，此網(wǎng)絡共包括228個節(jié)點、975個邊。節(jié)點分別表示麻黃加術(shù)湯潛在的活性成分與作用靶標。而圖中麻黃加術(shù)湯中多個靶標可對應相同的活性成分，一個靶標也可與不同的活性成分相對應，可見麻黃加術(shù)湯治療風濕性心臟病具有多成分、多靶標的特點。圖1中，連接較多的節(jié)點在整個網(wǎng)絡中起到樞紐的作用，可能是核心活性成分或者關(guān)鍵靶點，每個節(jié)點的大小根據(jù)Degree值來展示，經(jīng)Network Analyzer分析，Degree值排名前5位的中藥活性成分分別是槲皮素（quercetin）、木 犀 草 素（luteolin）、山 柰 酚（kaempferol）、柚皮素（naringenin）、甘草查爾酮A（licochalcone A）。排名前5位的靶標分別是人前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2），雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1），雄激素受體（androgen receptor，AR），一氧化氮合酶2（nitric oxide synthase 2，NOS2），過氧化物酶增生激活受體（peroxisome proliferative activated receptor gamma，PPARG）。

2.3靶標PPI網(wǎng)絡構(gòu)建圖2結(jié)果顯示，共同靶標PPI網(wǎng)絡共包括102個節(jié)點（已剔除1個游離節(jié)點）、1 678個邊。圖中Degree值越大則節(jié)點顏色越深，且節(jié)點越接近圖中圓心。麻黃加術(shù)湯治療風濕性心臟病的靶標中Degree值排名前5位的靶標為蛋白激酶Bα（protein kinase B alpha，PKBα，又稱AKT1）、白細胞介素6（interleukin 6，IL-6）、絲裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3），血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA），白細胞介素8（interleukin 8，IL-8，又稱CXCL8）。

圖2 麻黃加術(shù)湯治療風濕性心臟病共同靶標PPI網(wǎng)絡圖Figure 2 Protein-protein interaction network of rheumatic heart disease treated by Mahuangjiazhu Decoction

2.4 GO生物過程和KEGG通路富集分析圖3、4結(jié)果顯示：麻黃加術(shù)湯治療風濕性心臟病GO生物過程存在化學刺激、氧化應激、炎癥生成等多個條目；其KEGG富集通路有白細胞介素17（IL-17）信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、Toll樣受體（TLR）信號通路、輔助性T細胞17（Th17）細胞分化通路、T細胞受體（TCR）信號通路等。

圖3 活性成分對應靶標的GO生物過程分析Figure 3 GO biologicalprocess analysis of active ingredients-matched targets

圖4 活性成分對應靶標的KEGG通路富集分析Figure 4 KEGG signaling pathway enrichment analysis of active ingredient-matched target

2.5麻黃加術(shù)湯-風濕性心臟病靶標-KEGG通路網(wǎng)絡構(gòu)建圖5結(jié)果顯示，麻黃加術(shù)湯治療風濕性心臟病是一個涉及多個靶標及通路的過程。通路主要涉及IL-17信號通路、TNF信號通路、TLR信號通路、Th17細胞分化通路、TCR信號通路。

圖5 麻黃加術(shù)湯-風濕性心臟病靶標-KEGG通路網(wǎng)絡圖Figure 5 Network of Mahuangjiazhu Decoctionrheumatic heart disease target-KEGG signaling pathway

3 討論

麻黃加術(shù)湯由麻黃、桂枝、苦杏仁、甘草、白術(shù)組成，方中：麻黃辛溫走散，祛風以發(fā)表，功專開阻除痹，其通脈鎮(zhèn)痛效果居諸藥之首。無論是經(jīng)方，還是后世之經(jīng)典方劑，凡治痹名方，其中皆有麻黃，且無問寒熱虛實[10]。加白術(shù)以除濕而固里，又有桂枝和營達衛(wèi)，助麻黃以發(fā)表，杏仁疏肺降氣，導白術(shù)以宣中；更加甘草協(xié)和表里[11]，行開阻除痹之功。在麻黃加術(shù)湯活性成分-靶標-疾病相互作用網(wǎng)絡中，槲皮素、木犀草素、山柰酚、柚皮素、甘草查爾酮A與風濕性心臟病關(guān)聯(lián)性最高，且均屬黃酮類化合物。幾乎每一種黃酮類化合物都具有抗氧化活性，通過直接清除自由基、抑制活性氧簇（ROS）相關(guān)酶的產(chǎn)生，增加細胞分泌抗氧化介質(zhì)，保護心肌細胞[12]，通過清除自由基及降低促炎因子、上調(diào)抗炎因子，從而發(fā)揮抗炎作用[13]。其中，槲皮素在動物實驗中已被證實具有較好的心肌細胞保護作用，可能與其強抗氧化活性相關(guān)[14]；木犀草素也同樣被證實通過降低氧化應激損傷、調(diào)節(jié)炎癥因子分泌、調(diào)控多條信號通路，從而緩解炎癥反應，保護心臟[15]；山柰酚脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）抑制劑，抑制白三烯的產(chǎn)生、減輕炎癥反應[16]；低濃度的柚皮素可以減少前列腺素E2的生成，降低環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase 2，COX-2）的表達，而高濃度的柚皮素則可以抑制核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）的活化，從而減少炎癥反應的發(fā)生[17]；甘草查爾酮A則通過激活相關(guān)通路，抑制ROS導致的氧化應激，保護心肌細胞[18]。

與藥物活性成分關(guān)聯(lián)最密切的靶標分別是PTGS2、ESR1、AR、NOS2、PPARG。PTGS2是一種氧化應激相關(guān)因子，與介導炎癥生成的前列腺素生物合成有關(guān)[19]；ESR1為雌激素受體，與心力衰竭相關(guān)[20]；而AR則為雄激素受體，研究發(fā)現(xiàn)，AR在心肌中增加，與自身免疫性心肌炎進展的時間有關(guān)[21]；NOS2存在于免疫系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)中，在細胞受到刺激后被激活，在炎癥和細胞損傷中起重要作用[22]；PPARG參與體內(nèi)多種生理及病理過程，包括炎癥反應、細胞凋亡及動脈粥樣硬化等[23]。另一方面，風濕性心臟病PPI網(wǎng)絡中靶標AKT1、IL-6、CXCL8、MAPK3、VEGFA高表達。AKT1能促進氧化應激產(chǎn)生ROS和活性氮，導致大量自由基形成，進而損傷細胞[24]；IL-6與CXCL8屬于白細胞介素家族，是公認的重要炎癥因子；MAPK3被證實與全身性炎癥患者，如膿毒癥患者的預后相關(guān)[25]；VEGFA是血管內(nèi)皮生長因子家族成員，動物實驗研究表明，促進VEGFA表達可產(chǎn)生心肌保護的作用[26]。提示當麻黃加術(shù)湯治療風濕性心臟病時，方劑中的黃酮類化合物與上述靶標的調(diào)控密切相關(guān)。

經(jīng)GO與KEGG富集分析，在GO生物過程中，靶標主要集中于化學刺激、氧化應激、炎癥生成等作用；KEGG通路分析結(jié)果顯示，靶標主要涉及IL-17、TNF、TLR、Th17、TCR等信號通路。研究證實：關(guān)于IL-17信號通路，IL-17是T細胞誘導炎癥反應的早期啟動因子，IL-17與受體結(jié)合后，可通過MAPK3途徑和NF-κB途徑，促進釋放前炎性細胞因子來放大炎癥反應[27]；關(guān)于TNF信號通路，TNF-α抑制β-腎上腺素能受體，交感神經(jīng)激素的反饋增加，使促炎因子TNF-α升高，從而導致自我延續(xù)周期，而這種循環(huán)獨立于由損傷引起的促炎和抗炎反應，激活有害的信號通路機制，引發(fā)心肌肥大和心力衰竭[28]；關(guān)于TLR信號通路，TLR通過不同的識別途徑活化多種免疫細胞，啟動非特異性免疫應答并激起適應性免疫應答以清除病原體，該通路在炎癥、免疫細胞調(diào)控、存活和增殖方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[29]；關(guān)于Th17細胞分化通路，Th17細胞是由Th0細胞在IL-6和轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factorβ，TGF-β）的刺激，以及白細胞介素21（interleukin 21，IL-21）的促進下分化而成的，分化后促進中性粒細胞的動員、募集和活化，介導炎癥反應，因此它與自身免疫性疾病，感染性疾病以及腫瘤的發(fā)生均有密切的關(guān)系[30]；關(guān)于TCR信號通路，TCR能特異性識別抗原提呈細胞表面MHC提呈的抗原肽，通過誘導TCR鄰近酪氨酸激酶活化，促進信號傳遞復合物組裝，活化下游MAPK、PKC以及鈣離子等信號途徑，完成T細胞的活化，因此，TCR信號通路在細胞免疫方面起關(guān)鍵作用[31]?？偟膩碚f，上述生物過程、通路及其相互作用，可能與風濕性心臟病密切相關(guān)。

綜上所述，本研究揭示了麻黃加術(shù)湯治療風濕性心臟病的主要機制可能是方劑中的黃酮類化合物通過減低PTGS2、AKT1等介導的氧化應激，減少NOS2、PPARG、IL-6、CXCL8、MAPK3等炎癥因子的表達，干預IL-17、TNF、TLR、Th17、TCR等免疫與炎癥相關(guān)通路，從而發(fā)揮抗炎作用，保護心肌細胞。本課題組就麻黃加術(shù)湯治療風濕性心臟病的關(guān)鍵靶標、活性成分、關(guān)鍵信號通路及其復雜網(wǎng)狀相互作用關(guān)系進行數(shù)據(jù)挖掘及深入探究，為進一步進行分子機制研究及臨床應用提供了方向和依據(jù)。然而，本研究仍存在一定的局限性，例如中藥在實際應用中的來源和劑量未能納入研究，今后仍需深入探討。