補氣溫陽法對慢性阻塞性肺疾病肺陽虛證大鼠的治療作用及機制

馮毅， 鄭嵐， 闞競， 楊嵐， 黃帥， 楊來

（1.湖北省中醫(yī)院，湖北武漢 430061；2.湖北中醫(yī)藥大學第一臨床學院，湖北武漢 430061；3.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W校附屬醫(yī)院，重慶 404120）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種常見的以氣流受限為特征的可預防和治療的呼吸性疾病，常表現為氣流受限不完全可逆，漸進性肺功能惡化[1]，且其高患病率、高致殘率、高病死率及病程長等特點給患者及其家庭帶來了沉重的經濟負擔[2]。其發(fā)病機制復雜，多與香煙煙霧等有害氣體或顆粒對氣道及肺實質產生的非特異性炎癥反應有關，主要表現為抗炎因子與促炎因子的失衡，從而產生慢性氣道炎癥[2]。中醫(yī)藥在治療COPD相關疾病中有著悠久的臨床實踐經驗，且療效卓著，COPD是現代醫(yī)學病名，經中醫(yī)學者反復論證后，本病在中醫(yī)學中被歸屬于“肺脹”的范疇，主要癥狀為胸部膨滿、憋悶如塞、喘息上氣、咳嗽痰多、煩躁、心悸、面色晦暗，甚者肢體浮腫等[3]。COPD的臨床辨證分型多樣，其中，肺陽虛學說經過多年的發(fā)展與論證，已被大多數中醫(yī)學家所認同[4]。肺陽虛證在治療上當以補氣溫陽為主。據臨床觀察發(fā)現，運用補氣溫陽法能提升患者肺功能，對改善患者生活質量等方面效果顯著，且較西醫(yī)具有明顯的優(yōu)勢[5]。楊嵐[6]對湖北省中醫(yī)院肺病科2014—2015年收治的60位COPD肺陽虛患者進行臨床治療統(tǒng)計分析發(fā)現，同期患者中使用支氣管舒張劑聯合補氣溫陽中藥配方治療后病情改善情況顯著優(yōu)于單獨使用支氣管舒張劑治療者。馮毅辨治肺系疾病發(fā)現，補氣溫陽中藥可有效治療不同癥狀的肺陽虛患者[7]。因此，本研究觀察COPD肺陽虛證大鼠模型白細胞介素（IL）-8、IL-10、腫瘤壞死因子α（TNF-α）的動態(tài)變化來闡述COPD肺陽虛證的病理機制，使用自擬補氣溫陽中藥對COPD肺陽虛證大鼠進行干預，以期為COPD肺陽虛證的病情評估提供新的依據，同時也為補氣溫陽法治療COPD肺陽虛證提供更多的實驗依據?，F將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1動物清潔級Wistar雄性大鼠50只，平均體質量為（200±20）g，購自湖北省疾病預防控制中心，動物質量合格證號：SCXK（鄂）2017-0056。實驗于武漢華聯科模型動物研究院進行，于屏障環(huán)境中飼養(yǎng)大鼠，溫度為22～26℃，相對濕度為50%～60%，人工光照明暗各12 h。

1.2藥物及制備自擬補氣溫陽方中藥配方組成：黃芪30 g，白術12 g，防風、桂枝、白芥子、杏仁、肉蓯蓉、補骨脂、炙甘草各10 g，炙麻黃、干姜、五味子各6 g。以上中藥材均由湖北省中醫(yī)院制劑室提供。將上述藥物置于瓦罐中，加水至超過藥物平面，浸泡20 min后，先用武火煮沸，再改用文火煎煮10 min，濾出藥液。藥渣再按照上法煎煮1次，濾出藥液。將2次藥液混合，再武火煮沸即可。然后將此藥液濃縮成成品（生藥量1.0 g/mL），放置于冰箱中冷藏備用。

1.3試劑與儀器脂多糖（LPS）（美國Sigma公司）；“黃鶴樓”牌香煙（湖北中煙工業(yè)有限責任公司）；瑞氏-吉姆薩復合染色液（北京雷根生物技術有限公司）；大鼠IL-8、IL-10、TNF-α酶聯免疫吸附分析（ELISA）檢測試劑盒（武漢基因美科技有限公司）。有機玻璃熏煙箱（50 cm×40 cm×30 cm）自制；FCD-215SEA低溫可調式冷柜（青島海爾股份有限公司）；AVL-OPTI動脈血液氣體分析儀（羅氏瑞士公司）；普通顯微鏡（美國奧林帕斯公司）；低溫冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；酶標儀（美國Bio-Tek公司）。

1.4 COPD肺陽虛證大鼠模型制備將50只大鼠隨機分成2組，即正常組10只和造模組40只。將造模組大鼠先以煙熏及氣管內滴注LPS的方法建立COPD大鼠模型，再加以寒涼環(huán)境刺激，復制陽虛證的病因，通過病證結合的方式構建COPD肺陽虛證模型。具體操作步驟：在造模的第1天和第14天，每只大鼠行氣管內注入LPS（200μL/次），第2～49天（第14天除外）給予煙熏處理（50 g鋸末和刨花+香煙14支/次，共同點燃制作熏煙環(huán)境，30 min/次，1次/d），煙熏15 min后進行寒冷刺激，將大鼠置于可調冷柜內（0～2℃），2次/d，2 h/次[8]。每天固定時間記錄大鼠的飲水量及進食量，分別于第1、7、14、28、35、42、49天測量并記錄大鼠背部溫度及肛溫。正常組大鼠不做任何處理，正常飼養(yǎng)。

1.5補氣溫陽方的制備及模型大鼠的分組處理全部造模成功。造模結束后，將造模組40只大鼠隨機分成4組，即模型組，中藥低、中、高劑量干預組，每組各10只。中藥低、中、高劑量干預組根據人與動物體表面積折算出大鼠用藥劑量，分別給予補氣溫陽方煎液8.0、16.0、32.0 g·kg-1·d-1灌胃，持續(xù)灌胃30 d。模型組大鼠給予16 mL/kg生理鹽水灌胃。

1.6觀察指標與方法

1.6.1 各組大鼠動脈血氣指標檢測 將大鼠用20 g/L戊巴比妥鈉以3.0 mL/kg劑量腹腔內注射麻醉，采用肝素處理過的注射器行腹主動脈采血，立即進行動脈血氣指標檢測，分別測定二氧化碳分壓（PaCO2）及氧分壓（PaO2）。

1.6.2 各組大鼠血清中炎性細胞因子IL-8、IL-10及TNF-α指標檢測 經大鼠腹主動脈采血，以2 000 r/min離心處理15 min，收集血清。具體檢測步驟按照ELISA試劑盒說明書操作，經標準品的稀釋與加樣、加酶、溫育、配液、洗滌、顯色、終止及測定等步驟后，分別計算出IL-8、IL-10及TNF-α的實際濃度。

1.6.3 各組大鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）中白細胞（WBCs）、中性粒細胞（NEUTs）計數 將大鼠用20 g/L戊巴比妥鈉以3.0 mL/kg劑量腹腔內注射麻醉后，常規(guī)皮膚消毒，手術剪分離氣管前組織，暴露氣管，結扎遠心端氣管，用1 mL注射器行氣管插管，注入37℃生理鹽水0.5 mL，反復抽吸，重復3次。BALF回收率均在80%以上，收集置于1.5 mL的EP管中。取其中0.2 mL的BALF采用血細胞計數法在顯微鏡下進行WBCs計數。另取0.2 mL的BALF，離心重懸細胞沉淀涂片，晾干后行瑞氏-吉姆薩染色，在光學顯微鏡下觀察，對中性粒細胞進行分類計算，最終得出BALF中NEUTs的數量。

1.6.4 各組大鼠肺組織病理學變化觀察 BALF收集結束后，取大鼠的肺組織置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定24 h后，依次進行組織常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、冷凍、切片（約4μm）、貼片、烘片后，進行HE染色：切片脫蠟、染色、脫水后再行二甲苯透明，中性樹膠固定封片。光鏡下觀察肺組織病理學變化。

1.7統(tǒng)計方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間數據比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1各組大鼠動脈血氣指標比較表1結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠PaO2顯著降低（P<0.01），PaCO2顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，中藥低、中、高劑量干預組大鼠PaO2均顯著升高（P<0.01），而PaCO2均顯著降低（P<0.01），均呈劑量依賴性。

表1 各組大鼠動脈血氣指標比較Table 1 Comparison of the arterial blood gas indexes in rats of various groups （x±s，mmHg）

2.2各組大鼠血清中炎性細胞因子IL-8、IL-10及TNF-α指標變化比較表2結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清中IL-10水平均顯著降低（P<0.01），IL-8、TNF-α水平均顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，中藥低、中、高劑量干預組大鼠血清中IL-10水平均顯著上升（P<0.01），而IL-8、TNF-α水平則均顯著降低（P<0.01），均呈劑量依賴性。

表2 各組大鼠血清中IL-8、IL-10及TNF-α變化比較Table 2 Comparison of the levels of serum IL-8，IL-10 and TNF-αin rats of various groups （x±s，pg·mL-1）

2.3各組大鼠BALF中WBCs、NEUTs計數分析表3結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠BALF中WBCs、NEUTs數量均顯著升高（P<0.01）；而與模型組比較，中藥低、中、高劑量干預組大鼠BALF中WBCs、NEUTs數量均不同程度降低（P<0.05或P<0.01），且呈劑量依賴性。

表3 各組大鼠支管肺泡灌洗液（BALF）中WBCs及NEUTs計數分析Table 3 Analysis of the counts of WBCs and NEUTs in BALF in rats of various groups（x±s，106個·L-1）

2.4各組大鼠肺組織病理學變化比較圖1結果顯示：正常組大鼠肺泡結構正常連續(xù)，肺泡壁完整，未見炎癥細胞浸潤。與正常組比較，模型組大鼠肺泡結構雜亂，肺泡壁斷裂，膠原纖維增生明顯，肺泡腔明顯擴大，部分融合成肺大皰，同時伴有大量炎癥細胞浸潤；與模型組比較，中藥低、中、高劑量干預組大鼠肺泡破損程度有所減輕，炎癥細胞數目減少，肺泡結構逐漸趨于正?；?，其中以高劑量的中藥干預組大鼠肺組織病理變化改善最為顯著。

圖1 各組大鼠肺組織病理變化比較（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of the pathologicalchanges in rat lung tissue in various groups（by HE staining method，×200）

3 討論

肺陽虛是慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者的常見病證，貫穿穩(wěn)定期的整個過程[9]。寒邪侵襲，首先犯肺，從而導致肺氣受損、虧盈，陽氣不足，內生寒邪發(fā)展為陽虛[7]。臟腑互通[10]，長期肺陽虛則會影響他臟，子病及母，累及脾臟，母病及子，累及腎臟，加之脾虛，無以養(yǎng)腎，導致腎氣虧虛，動則氣喘，長則終致氣損及陽，陰寒內生[11]。本研究根據肺陽虛COPD患者的發(fā)病原因，模擬病因建立肺陽虛證COPD大鼠模型。以香煙煙絲配合鋸末、刨花點燃制煙為外邪，以冰柜環(huán)境制外寒[8]。對模型大鼠采用自擬補氣溫陽中藥進行干預治療，方中：黃芪具有補氣升陽、益衛(wèi)固表之功，直接參與機體的免疫調節(jié)作用[12]。防風具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、鎮(zhèn)靜、抗菌、抗腫瘤、抗過敏、提高機體免疫、抗凝血等藥理作用[13]。黃芪健脾益氣，白術健脾祛濕，二者可助脾之運化功能恢復，從而助力組方藥效達肺經[6-7]。黃芪合防風，可行祛邪氣而不傷正氣之功[6]。桂枝、麻黃溫通肺陽，干姜、白芥子溫肺化飲，相互配伍使用，共行溫陽化氣之功，以溫補肺陽，溫通肺經。配伍苦杏仁，可止咳平喘，肉蓯蓉、補骨脂可補腎納氣、溫腎陽，五味子則行上斂肺氣，下滋腎陰之功[6-7，14]。灸甘草及其提取物具有鎮(zhèn)咳、平喘、痰祛、抗呼吸道病原體、抗炎、鎮(zhèn)痛、調節(jié)免疫等作用[15]，同時，甘草可調和諸藥藥性，行使藥之職[7，14]。全方配伍使用以達治療肺陽虛之效。

COPD可導致肺部進入的有效氣體量減少，使機體處于相對缺氧的狀態(tài)，可引發(fā)動脈血PaO2降低、PaCO2升高等并發(fā)癥，因此，PaO2和PaCO2可間接反映出機體肺功能[16]。賈琦等[17]通過臨床治療的回顧性分析證明PaO2和PaCO2在COPD的臨床診斷和鑒別診斷上具有重要的借鑒價值，因此，可用于模型的鑒定。本研究結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠PaO2顯著降低，PaCO2顯著增加，提示COPD大鼠模型構建成功。補氣溫陽法治療COPD肺陽虛證大鼠后，大鼠動脈血PaO2提升，PaCO2降低，提示補氣溫陽法可改善COPD肺陽虛證大鼠肺功能。慢性氣道炎癥刺激是COPD的主要發(fā)病因素之一，參與COPD炎癥反應的細胞通過釋放不同的酶、炎癥介質，引起一系列炎癥改變，損傷支氣管內皮細胞，長期慢性的炎癥刺激導致氣道重構，引起氣道及肺組織的損傷、氣道阻塞、氣流受限等[18]。長期煙霧及污染的空氣環(huán)境等因素刺激會導致的機體氧化-抗氧化平衡失調，過剩的氧化物可破壞蛋白質、脂質等生化分子，導致肺部血管、肺組織等的損傷，刺激并加重炎癥反應[19-20]。研究發(fā)現，WBCs數量升高與COPD死亡率相關，IL-8、IL-10及TNF-α水平也與臨床COPD的治療結果有關[21]。NEUTs、嗜酸性粒細胞增多是COPD加重的標準之一[22]。本次研究結果顯示，模型組大鼠肺組織出現肺泡結構雜亂、肺泡壁斷裂、膠原纖維增生等COPD顯著癥狀，且出現大量WBCs和NEUTs細胞，進一步提示模型組大鼠COPD模型構建成功，而經補氣溫陽法治療可改善COPD肺陽虛證大鼠肺組織的病理變化，減輕炎癥浸潤，降低血清中促炎因子IL-8、TNF-α水平，升高抗炎因子IL-10水平，且減少WBCs和NEUTs的數量，提示補氣溫陽中藥可減輕COPD肺陽虛證大鼠炎癥反應。

綜上所述，補氣溫陽法能通過調節(jié)機體促炎-抗炎因子表達平衡，發(fā)揮減輕COPD肺陽虛證大鼠炎癥反應、改善肺功能的作用。