不同蛋白源飼料中添加限制性氨基酸對紅鯽Carassius auratus 生長、消化及免疫能力的影響

石立冬，衛(wèi)力博，翟浩杰，牟玉雙，侯仁爽，任同軍，韓雨哲,2

（1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023；2.大連海洋大學(xué)，遼寧省北方魚類應(yīng)用生物學(xué)與增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023）

肉粉蛋白質(zhì)含量高,碳水化合物含量低,維生素和礦物質(zhì)豐富[1]，水產(chǎn)動物飼料中常見的蛋白源，但消化率低、質(zhì)量不穩(wěn)定，制約了其在水產(chǎn)飼料中的發(fā)展[2]；玉米蛋白粉為常見的植物性蛋白源之一，其蛋氨酸和賴氨酸含量較低[3-5]，同樣存在肉粉的限制性因素。通常認(rèn)為，蛋氨酸和賴氨酸是第一、二限制性氨基酸；飼料中缺乏必需氨基酸時，大西洋鮭Salmo salar[6]、尖吻鱸Lates calcarifer[7]和凡納濱對蝦Penaeus vannamei[8]的攝食量和生長性能降低，羅非魚Oreochromis niloticus[9]、淡水鯰Mystus nemurus[10]的飼料效率降低，蛋白質(zhì)沉積率降低。Gaylord 等[11]及黎慧等[12]研究表明，補(bǔ)充限制性氨基酸可提高蛋白源利用率。限制性氨基酸在水產(chǎn)動物的腸道發(fā)育、消化代謝、免疫能力和抗氧化能力等方面具有一定的調(diào)節(jié)作用[13-16]。紅鯽Carassius auratus 屬鯉科鯉亞科鯽屬，以繁殖速度快、繁殖能力強(qiáng)、肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富而著名，是我國重要的淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)種類，具有較高的經(jīng)濟(jì)價值。目前，在水產(chǎn)養(yǎng)殖研究中針對肉粉和玉米蛋白粉替代魚粉的研究常見報道，但對肉粉和玉米蛋白粉兩種蛋白源的作用效果比較卻鮮有報道。本實驗以肉粉和玉米蛋白粉為主要的蛋白源，添加蛋氨酸和賴氨酸兩種限制性氨基酸，配制成不同蛋白源和限制性氨基酸飼料，旨在探討肉粉和玉米蛋白粉蛋白源飼料以及限制性氨基酸對紅鯽的作用，并為促進(jìn)肉粉和玉米蛋白粉在紅鯽飼料中的應(yīng)用開發(fā)及進(jìn)一步降低飼料成本提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

225 尾實驗魚購自大連市香爐礁，在200 L 聚乙烯水槽中暫養(yǎng)1 周。暫養(yǎng)期間飼喂對照組飼料，待實驗魚適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境后開始實驗。

實驗飼料配方、飼料蛋氨酸、賴氨酸含量實測值及紅鯽實際需求量[17]見表1（飼料中肉粉和玉米蛋白粉的比例設(shè)計依據(jù)目前養(yǎng)殖生產(chǎn)中紅鯽常用飼料配比），對照組飼喂MM組飼料，飼料中肉粉比例為7%，實驗組飼料分為3 種，CGM組用玉米蛋白粉完全替代肉粉，飼料中玉米蛋白粉比例為8%，MM+CAA 組和CGM+CAA 組分別在MM 組和CGM組中添加0.1%的晶體蛋氨酸和賴氨酸（由宜興市天石飼料有限公司提供）。飼料原料過80 目篩，逐級混勻，混合后的粉狀飼料經(jīng)制粒機(jī)制成直徑為2 mm的顆粒飼料，然后放入烘箱（DK-S26，上海森信實驗儀器有限公司）中42℃烘干至水分含量為10%，于-20℃冰箱中保存。

1.2 實驗設(shè)計和管理

實驗魚馴養(yǎng)7 d 后，選取大小一致、活力較好，初始體質(zhì)量為（3.37±0.03）g 的紅鯽180 尾，隨機(jī)分為4 組，每組設(shè)3 個重復(fù)，每個重復(fù)15 尾魚，以曝氣24 h 以上的自來水作為實驗用水，采用氣石24 h充氣，每日8:00 和16:00 投喂兩次，表觀飽食,每日吸底1 次、換水1 次，換水量約為1/2，實驗期間水溫為（23±1）℃，溶氧為（5±0.5）mg/L，pH 為（7.3±0.5），養(yǎng)殖周期為56 d。

1.3 樣品采集及指標(biāo)測定方法

取樣前，實驗魚停食24 h，放入冰水中，用濃度為100 mg/L 的MS-222 進(jìn)行麻醉處理，稱重測量體長，計算其生長指標(biāo)；稱重后，于冰上進(jìn)行無菌解剖，每個重復(fù)15 尾魚全部取肝臟、腸道及背部肌肉，同組混樣裝入樣品管。肌肉樣品于-80℃冰箱中保存，用于測定肌肉中蛋氨酸（methionine，Met）、賴氨酸（lysine，Lys）、總必需氨基酸（total indispensable amino acid，∑IDAA）和總氨基酸（total amino acid，∑AA）含量；腸道和肝臟樣品分別注入質(zhì)量體積比為1∶9 的生理鹽水，經(jīng)4℃、4000 r/min、10 min 高速離心后，取上清液，4℃保存，用于測定腸道脂肪酶（lipase，LPS）、淀粉酶（amylase，AMS）、蛋白酶（protease，PRO）和肝臟酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）、過氧化氫酶（catalase from micrococcus lysodeikticu，CAT）和總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，上述酶活指標(biāo)均利用南京建成生物工程研究所試劑盒進(jìn)行測定。

實驗飼料和肌肉樣品氨基酸測定前處理參考國標(biāo)法（GB 5009.124 2016），使用全自動氨基酸分析儀（L-8900 型，日立制作所）測得。

1.4 計算公式與數(shù)據(jù)處理

特定生長率（specific growth rates，SGR，%/d）=100×（ln 終末體質(zhì)量-ln 初始體質(zhì)量）/飼養(yǎng)天數(shù)；增重率（weight gain rate，WGR,%）=100×（平均終末體質(zhì)量-平均初始體質(zhì)量）/平均初始體質(zhì)量；飼料系數(shù)（food conversion ratio，F(xiàn)CR）=平均飼料攝入量/（終末平均體質(zhì)量-初始平均體質(zhì)量）；肥滿度（condition factor，CF）=100×終末體質(zhì)量×體長-3；攝食率（food intake，F(xiàn)I，%）=100×攝入飼料干重/[飼養(yǎng)天數(shù)×（初始體質(zhì)量+終末體質(zhì)量）/2]。

表1 實驗飼料組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Tab.1 Ingredients and nutrient levels of experimental diets（air-dry basis）/%

實驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±standard error，SE）表示，用SPSS 17.0 軟件（IBM，USA）進(jìn)行雙因素方差分析（two-way ANOVA）分析。當(dāng)?shù)鞍自春途w氨基酸之間存在顯著交互作用時，再對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行一次單因素方差分析（one-way ANOVA），并采用Duncan’s 進(jìn)行多重比較來分析各處理組間的顯著性，設(shè)置P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料蛋白源和兩種限制性氨基酸對紅鯽生長性能的影響

飼料蛋白源和氨基酸對紅鯽的SGR、WGR、CF和FCR 存在顯著交互作用（P＜0.05）。MM組與CGM組相比，WGR、CF 顯著提高（P＜0.05），F(xiàn)CR 顯著下降（P＜0.05）；MM+CAA 組與MM組相比，SGR、WGR、CF 顯著提高（P＜0.05）；CGM+CAA 組與CGM 組相比，F(xiàn)CR 顯著下降（P＜0.05），但SGR、WGR 和CF 無顯著變化（P＞0.05）；且MM+CAA 組的SGR、WGR、CF 顯著高于其余各組（P＜0.05）組，MM組FCR 最低，但MM+CAA 組與MM 組無顯著差異（P＞0.05）（表2）。

2.2 飼料蛋白源和兩種限制性氨基酸對紅鯽肌肉Met、Lys、∑IDAA 和∑AA 的影響

飼料蛋白源和氨基酸對紅鯽肌肉Met 和Lys 含量存在顯著交互作用（P＜0.05），但對∑IDAA 和∑AA 無顯著交互作用（P＞0.05）。MM組與CGM組相比，肌肉Met 和Lys 含量顯著升高（P＜0.05）；MM+CAA組與MM 組相比，肌肉Met 和Lys 含量顯著升高（P＜0.05）；CGM+CAA 組與CGM組相比，肌肉Met、Lys 含量顯著升高（P＜0.05）；且肌肉Met 和Lys 含量在MM+CAA 組顯著高于其余各組（P＜0.05）（表3）。

表2 飼料蛋白源和兩種限制性氨基酸對紅鯽生長性能的影響Tab.2 Effect of feed protein source and two kinds of limited amino acids on growth performance of red crucian carp Carassius auratus

表3 飼料蛋白源和兩種限制性氨基酸對紅鯽肌肉Met、Lys、∑IDAA 和∑AA 的影響Tab.3 Effect of feed protein source and two kinds of limited amino acids on Met,Lys,∑IDAA,and ∑AA contents in muscle of red crucian carp Carassius auratus

2.3 飼料蛋白源和兩種限制性氨基酸對紅鯽腸道消化能力的影響

由表4 可知，飼料蛋白源和氨基酸對LPS 和PRO 活力的交互作用顯著（P＜0.05），但對AMS 活力無顯著交互作用（P＞0.05）；MM+CAA 組與MM 組相比，LPS 和PRO 活力顯著提高（P＜0.05）；CGM+CAA組與CGM 組相比，LPS 和PRO 活力顯著提高（P＜0.05）；且LPS 和PRO 活力均在MM+CAA 組顯著高于其余各組（P＜0.05）。

2.4 飼料蛋白源和兩種限制性氨基酸對紅鯽肝臟免疫能力的影響

飼料蛋白源和氨基酸對紅鯽的ACP、AKP、CAT、SOD 活力和MDA 含量有顯著交互作用（P＜0.05）。MM組與CGM組相比，ACP、CAT 和SOD活力顯著提高（P＜0.05），MDA 含量顯著下降（P＜0.05），AKP 活力無顯著變化（P＞0.05）；MM+CAA 組與MM組相比，ACP、AKP、CAT 和SOD 活力顯著提高（P＜0.05），MDA 含量顯著下降（P＜0.05）；CGM+CAA 組與CGM 組相比，ACP、AKP、CAT 和SOD 活力顯著提高（P＜0.05），MDA 含量無顯著變化（P＞0.05）；MM+CAA 組的ACP、AKP、CAT 和SOD 活力顯著高于其余各組（P＜0.05），MM+CAA 組中MDA含量顯著低于其余各組（P＜0.05）（表5）。

3 討論

3.1 飼料蛋白源和兩種限制性氨基酸對紅鯽生長性能的影響

通常認(rèn)為，賴氨酸和蛋氨酸是魚類的第一和第二限制性氨基酸，對維持生物正常的生長發(fā)育具有重要作用[18-21]。已有研究表明，飼料中添加Met 可以不同程度地提高草魚Ctenopharyngodon idella[22]、南亞野鯪Labeo rohit H.[23]、細(xì)鱗巨脂鯉Piaractus mesopotamicus[24]和松浦鏡鯉Cyprinus carpio L.[25]的增重率、特定生長率及蛋白質(zhì)效率；可以提高虹鱒Oncorhynchus mykiss[26]、斑點叉尾鮰Ictalurus punc－tatus[27]和建鯉Cyprinus carpio var.Jian[28]的相關(guān)生長基因的表達(dá)量。與此類似，飼料中添加Lys，可以提高勃氏雅羅魚Leuciscus brandti[29]和團(tuán)頭魴Megalobrama amblycephala[30]的生長性能。特定生長率、增重率和肥滿度等指標(biāo)通常是魚類營養(yǎng)學(xué)研究中用來評價魚類機(jī)體生長速率和體質(zhì)量增長幅度的指標(biāo)，飼料系數(shù)（FCR）等指標(biāo)通常是用來評價飼料利用率的指標(biāo)[31,32]。本研究結(jié)果表明，肉粉蛋白源飼料與玉米蛋白粉蛋白源飼料相比，顯著提高了紅鯽的WGR 和SGR，顯著降低了FCR，說明在未添加限制性氨基酸時，肉粉蛋白源飼料更有利于紅鯽生長；添加限制性氨基酸后，肉粉蛋白源飼料添加組與未添加組相比，紅鯽生長指標(biāo)得到了顯著改善，而玉米蛋白粉蛋白源飼料添加組與未添加組相比，紅鯽的生長指標(biāo)沒有顯著變化，說明肉粉蛋白源飼料中限制性氨基酸的添加促進(jìn)了紅鯽的生長，但玉米蛋白粉蛋白源飼料與限制性氨基酸之間可能存在某種拮抗機(jī)制，導(dǎo)致限制性氨基酸并未發(fā)揮促進(jìn)作用，但目前對于這種拮抗機(jī)制的具體作用方式尚不明確，仍有待進(jìn)一步研究。肉粉蛋白源飼料中添加限制性氨基酸后，紅鯽的SGR、WGR 和CF 與其余各組相比顯著提高，F(xiàn)CR 顯著低于玉米蛋白粉蛋白源無添加組，說明肉粉蛋白源飼料中添加0.1%的兩種限制性氨基酸更適合紅鯽的生長需求。

表4 飼料蛋白源和兩種限制性氨基酸對紅鯽腸道消化能力的影響Tab.4 Effect of feed protein source and two kinds of limited amino acids on intestinal digestive capacity of red crucian carp Carassius auratus /U·mg prot-1

表5 飼料蛋白源和兩種限制性氨基酸對紅鯽免疫能力的影響Tab.5 Effect of feed protein source and two limited amino acids on liver Immunity of red crucian carp Carassius auratus

3.2 飼料蛋白源和兩種限制性氨基酸對紅鯽肌肉Met、Lys、∑IDAA 和∑AA 的影響

飼料中氨基酸含量與魚類肌肉氨基酸含量密切相關(guān)。研究表明，飼料中缺乏蛋氨酸時，黑鯛Sparus macrocephalus[33]、大黃魚Pseudosciaena crocea[34]和胭脂魚Myxocyprinus asiaticus[35]肌肉中的總必需氨基酸含量降低，且隨著飼料中蛋氨酸濃度增加，肌肉中蛋氨酸的含量也升高，說明日糧中蛋氨酸缺乏會降低組織中蛋氨酸的含量[34]；隨著飼料中賴氨酸含量的升高，黑鯛[36]、黃顙魚Pelteobagrus fulvidraco[21]和軍曹魚Rachycentron canadum 幼魚[37]肌肉賴氨酸和蛋氨酸含量升高，說明飼料中蛋氨酸、賴氨酸含量與魚體肌肉組織中蛋氨酸、賴氨酸和含量存在一定的正相關(guān)。本研究中，肉粉蛋白源飼料與玉米蛋白粉蛋白源飼料相比，顯著提高了肌肉Met 和Lys含量，說明肉粉蛋白源飼料對改善紅鯽肌肉蛋氨酸和賴氨酸組成的效果更顯著；在不同蛋白源飼料中添加0.1%的兩種限制性氨基酸后，與未添加限制性氨基酸組相比，紅鯽肌肉Met 和Lys 含量顯著提高，與上述研究結(jié)果相符，說明飼料中蛋氨酸和賴氨酸含量的升高可以導(dǎo)致肌肉蛋氨酸和賴氨酸含量的升高，且在本實驗條件下，肉粉蛋白源飼料中添加限制性氨基酸后，紅鯽肌肉的Met 和Lys 含量顯著高于其余各組，說明在肉粉蛋白源飼料中添加限制性氨基酸改善紅鯽肌肉蛋氨酸和賴氨酸含量的效果顯著優(yōu)于其余各組飼料。

3.3 飼料蛋白源和兩種限制性氨基酸對紅鯽腸道消化能力的影響

腸道是動物消化吸收的主要場所，魚類主要依靠腸道中的消化酶進(jìn)行化學(xué)性消化，因此，腸道消化酶活性在一定程度上可以反映魚類對飼料原料和營養(yǎng)成分的消化吸收能力[38]。鄢華[39]在探究賴氨酸缺乏對幼建鯉Cyprinus carpiovar Jian 的影響中發(fā)現(xiàn)，賴氨酸缺乏可極顯著降低蛋白酶活性，但對淀粉酶活性的影響不顯著；彭艷等[40]在蛋氨酸對幼建鯉的生長影響的研究中發(fā)現(xiàn)，適量的蛋氨酸可以顯著提高蛋白酶的活性；帥柯[41]研究表明，飼料蛋氨酸水平對脂肪酶和蛋白酶活力存在顯著影響，適量的蛋氨酸水平可以顯著提高脂肪酶和蛋白酶的活性。本實驗條件下，在不同蛋白源飼料中添加0.1%的兩種限制性氨基酸，紅鯽腸道的LPS 和PRO 活性顯著提高，說明在肉粉蛋白源和玉米蛋白粉蛋白源飼料中添加限制性氨基酸能夠改善紅鯽腸道的消化能力，且添加限制性氨基酸后，LPS 和PRO 活性在肉粉蛋白源飼料組顯著高于其余各組，說明肉粉蛋白源飼料中添加限制性氨基酸后對腸道消化酶活力的改善效果顯著優(yōu)于其余各組飼料。這些消化酶活性的顯著提高可以相對解釋肉粉蛋白源飼料中添加0.1%兩種限制性氨基酸條件下的高生長性能。

3.4 飼料蛋白源和兩種限制性氨基酸對紅鯽肝臟免疫能力的影響

鯉科魚類的免疫系統(tǒng)包括非特異性免疫和特異性免疫系統(tǒng)[42]。Salinas 等[43]認(rèn)為，魚類等低等脊椎動物機(jī)體的防御主要靠非特異性免疫系統(tǒng)，因此，ACP、AKP 等重要的非特異性免疫因子[44-46]的活性在一定程度上可以反映機(jī)體的免疫能力。孫崇巖等[47]和帥柯[41]發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加適量的晶體蛋氨酸可以顯著提高建鯉的特異性和非特異性免疫能力。Ruchimat 等[48]發(fā)現(xiàn)，隨著飼料中賴氨酸含量的增加，黃尾鰤Seriola lalandi 的免疫能力也呈現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢。本實驗中，未添加限制性氨基酸時，肉粉蛋白源飼料與玉米蛋白粉蛋白源飼料相比顯著提高了紅鯽肝臟ACP 活力，在不同蛋白源飼料中添加0.1%的兩種限制性氨基酸，紅鯽肝臟的ACP 和AKP 活力均顯著提高，且添加限制性氨基酸后，肉粉蛋白源飼料對肝臟ACP、AKP 活力的改善效果顯著優(yōu)于其余各組飼料。

SOD 和CAT 是生物防御體系中的關(guān)鍵酶[49]。SOD 為清除體內(nèi)自由基的活性氧清除劑，對增強(qiáng)整個機(jī)體的抗氧化能力具有重要作用[50]。CAT 與SOD具有協(xié)同作用，可以清除機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的超氧陰離子（O2-）和H2O2等自由基[51]。MDA 為機(jī)體內(nèi)脂肪過氧化的終產(chǎn)物，其含量可以反映機(jī)體中脂肪過氧化程度及集體損傷程度[52]。研究表明，蛋氨酸可顯著降低鱸Lateolabrax japonicus 肝臟中的脂質(zhì)過氧化水平和GSH 含量[53,54]。廖英杰[55]發(fā)現(xiàn)，團(tuán)頭魴血清超氧化物歧化酶活力與飼料中賴氨酸的含量呈正相關(guān)；本實驗條件下，未添加限制性氨基酸時，肉粉蛋白源飼料與玉米蛋白粉蛋白源飼料相比顯著提高了紅鯽肝臟CAT 和SOD 活力，顯著降低了肝臟MDA 含量，在不同蛋白源飼料中添加0.1%的兩種限制性氨基酸，紅鯽肝臟的CAT 和SOD 活力均顯著提高，且添加限制性氨基酸后，肉粉蛋白源飼料組紅鯽肝臟CAT 和SOD 活力顯著高于其余各組飼料，肝臟MDA 含量顯著低于其余各組。綜上所述，肉粉蛋白源和玉米蛋白粉蛋白源飼料中添加兩種限制性氨基酸可以在一定程度上提高魚類的肝臟免疫能力，改善抗氧化能力，其改善效果以肉粉蛋白源飼料添加限制性氨基酸更顯著。

3.5 結(jié)論

本實驗中，在以肉粉為主要蛋白源的飼料中添加蛋氨酸和賴氨酸兩種限制性氨基酸后，紅鯽的特定生長率、增重率、肥滿度、飼料系數(shù)，肌肉蛋氨酸、賴氨酸含量，腸道消化酶活力，肝臟免疫酶活力及抗氧化酶活力均顯著提高，且蛋白源和氨基酸對上述指標(biāo)存在一定的交互作用，但其交互作用機(jī)制尚不明確。綜上所述，初始體質(zhì)量為（3.37±0.03）g 紅鯽的飼料中，以肉粉為主要蛋白源時添加賴氨酸和蛋氨酸可以顯著改善其生長、消化、免疫、抗氧化性能及肌肉中蛋氨酸、賴氨酸含量，提高飼料利用率，降低成本。