溫度和pH 對(duì)翹嘴紅鲌消化酶活性的影響

韓慶，凌卯梅，龔麗軍，趙莉，謝中國(guó)，楊品紅

（湖南文理學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 常德 415000）

翹嘴紅鲌Erythroculter ilishaeformis，又名翹嘴巴、翹鲌子、鲌魚，屬于鯉科、紅鲌屬，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。人工輔助魚類繁殖技術(shù)的不斷發(fā)展和配合餌料的成功開發(fā)，翹嘴紅鲌的養(yǎng)殖面積在不斷擴(kuò)大，并成為人工養(yǎng)殖魚類的重點(diǎn)對(duì)象。體外消化率和消化道生理特征的研究發(fā)現(xiàn)，翹嘴紅鲌與典型的肉食性魚類體型相近，但翹嘴紅鲌的口裂小于典型的肉食性魚類[2]。消化酶是消化腺分泌的一種消化分解攝入食物的酶，消化酶對(duì)魚類的生長(zhǎng)、發(fā)育和生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)具有重要的作用[3]。國(guó)內(nèi)外有關(guān)魚類消化酶的研究較多[4-14]。如對(duì)翹嘴紅鲌不同消化部位主要消化酶活力[1]、不同溫度下翹嘴紅鲌幼魚脂肪酶的活性[2]、湖泊中4 種野生鲌消化酶活性[15]及飼料中不同蛋白水平[16]和脂肪含量[17]對(duì)其消化酶活性的影響等進(jìn)行了研究。有關(guān)溫度和pH 對(duì)翹嘴紅鲌消化酶活性影響的系統(tǒng)研究還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過研究在不同溫度和pH 下翹嘴紅鲌主要消化酶活性的變化，以期為翹嘴紅鲌飼料開發(fā)及合理投喂提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

自西洞庭氈帽湖養(yǎng)殖基地隨機(jī)取游泳活潑、無病無傷的翹嘴紅鲌6 尾，魚體長(zhǎng)25.50～31.00 cm，體質(zhì)量248.50～285.37g。

1.2 方法

將活魚放置在冰盤上快速解剖，取肝胰臟、腸道并剔除附著物，用提前預(yù)冷過的生理鹽水沖洗兩次，然后用吸水紙吸去表面水分，將腸道切分為前腸、中腸和后腸：腸道的第一個(gè)回折點(diǎn)的前端是前腸、最后一個(gè)回折點(diǎn)的后端是后腸、中間的一段就是中腸[2]，加入體積大約是樣品體積10 倍的提前預(yù)冷的緩沖液，在研缽中研磨勻漿，轉(zhuǎn)入1.5 mL 的離心管中，用高速冷凍離心機(jī)（5417R 型）在0～4℃，20 000 r/min 條件下離心6 min[2]，上清液為粗酶液，密閉封裝置于-20 ℃冰箱中冷凍保存?zhèn)溆茫?4 h 內(nèi)測(cè)定完各消化酶活性。

溫度及pH 梯度設(shè)定：采用恒溫水浴鍋調(diào)節(jié)溫度，在25～50℃范圍內(nèi)，以5℃為幅度，共設(shè)定6 個(gè)梯度，對(duì)照溫度100℃，在緩沖液pH 為7.4 的條件下，測(cè)定各溫度下肝胰臟、前腸、中腸和后腸中各種消化酶的活性[4]。

pH 以0.4 為幅度，分別設(shè)定pH 為6.2、6.6、7.0、7.4、7.8，在28℃下，測(cè)定各pH 下肝胰臟、前腸、中腸和后腸各消化酶的活性，在相同的溫度條件下，以酶在各pH 梯度下活性最高時(shí)的pH 作為其最適pH[15]。

1.3 酶活力測(cè)定

蛋白酶：參照文獻(xiàn)[14]的方法測(cè)定蛋白酶活力。在反應(yīng)試管中加入0.4 mL 1%酪蛋白溶液及1 mL酶液，反應(yīng)10 min 后放入沸水中加熱5 min，使酶失活，再加入3 mL 考馬斯亮藍(lán)染色液染色10 min，加入3.6 mL 緩沖液稀釋后，于595 nm 處測(cè)定吸光值。以1 min 內(nèi)底物酪蛋白被分解產(chǎn)生1 μg 酪氨酸所需要蛋白酶的量為1 個(gè)酶活力單位（IU）[13]。

淀粉酶：加入0.4 mg/mL 淀粉底物緩沖液0.05 mL，25℃水中預(yù)熱，加入2 mL 酶液混勻，反應(yīng)10 min，加入3 mL 緩沖液稀釋，在660 nm 處測(cè)定吸光值。以1 min 內(nèi)1 μg 淀粉被分解所需要的酶量為一個(gè)淀粉酶的活力單位（IU）[2]。

脂肪酶：加入460 μmol/L 的甘油三脂4 mL，水浴10 min，再加入酶液0.05 mL，混勻（輕拿輕放，不要用力震蕩）后倒入比色皿中，在420 nm 處測(cè)定吸收值記為A1，然后立即將混合液倒回對(duì)應(yīng)的試管中，放在相應(yīng)溫度中反應(yīng)15 min，再測(cè)定一次吸光值記為A2。以1 min 內(nèi)底物甘油三酯被分解產(chǎn)生1 mg 脂肪酸所需要的酶量為1 個(gè)脂肪酶的活力單位（IU）[18]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

用Excel 表格對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理及作圖，用SPSS17.0 進(jìn)行方差分析及差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)翹嘴紅鲌3 種消化酶活性的影響

不同溫度條件下，翹嘴紅鲌肝胰臟、前腸、中腸和后腸中蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的活性見圖1～圖3。

由圖1 可知，翹嘴紅鲌不同部位蛋白酶活性均在45℃時(shí)最高，肝胰臟為275.36 IU、前腸為201.58 IU、中腸為166.24 IU、后腸為150.49 IU。肝胰臟中蛋白酶活性大于腸道各部位且有顯著差異（P＜0.05）；腸道中蛋白酶活性由前向后逐漸降低，但各段間差異不顯著（P＞0.05）。消化道不同部位蛋白酶活性隨溫度的變化趨勢(shì)基本一致，肝胰臟蛋白酶活性45℃＞40℃＞35℃＞30℃、50℃＞25℃，其中45℃、40℃間及30℃與25℃間無顯著差異（P＞0.05），其他各溫度間差異顯著（P＜0.05）；前腸45℃＞40℃＞50℃、35℃、30℃、25℃（P＜0.05）；中腸與后腸45℃＞40℃、35℃＞30℃、50℃、25℃（P＜0.05）。

圖1 不同溫度對(duì)翹嘴紅鲌腸和肝胰臟蛋白酶活性的影響Fig.1 Effects of different temperatures on protease activities in intestine and hepatopancreas of Erythroculter ilishaeformis

由圖2 可知，翹嘴紅鲌不同部位淀粉酶活性達(dá)峰值時(shí)的溫度不同：肝胰臟為30℃，而腸道為40℃；肝胰臟淀粉酶活性峰值為377.42 IU、前腸為145.37 IU、中腸為300.57 IU、后腸為159.39 IU，肝胰臟中最高，腸道由高至低依次為：中腸＞后腸＞前腸，3段間差異顯著（P＜0.05），前腸與后腸間差異不顯著（P＞0.05），肝胰臟顯著高于中腸（P＜0.05）。不同部位同一溫度下比較，25℃、30℃、35℃均為肝胰腺高于中腸（P＜0.05），中腸高于前腸和后腸（P＜0.05），前腸和后腸間差異不顯著（P＞0.05）；40℃時(shí)肝胰腺和中腸顯著高于前腸和后腸（P＜0.05），肝胰腺和中腸、前腸和后腸間差異不顯著（P＞0.05）；45℃時(shí)前腸高于中腸、后腸（P＞0.05），前中后腸均顯著高于肝胰腺（P＜0.05）；50℃時(shí)4 個(gè)部位間無顯著差異（P＞0.05）。不同溫度下淀粉酶的變化是：肝胰臟35℃＞40℃＞30℃＞25℃＞45℃、50℃（P＜0.05），前腸和后腸變化相似，均為40℃＞45℃、35℃、30℃＞25℃、50℃（P＜0.05），中腸40℃＞35℃＞30℃＞45℃＞25℃＞50℃（P＜0.05）。

由圖3 可知，不同部位脂肪酶活性均在40℃時(shí)最高，肝胰臟中83.23 IU、前腸65.14 IU、中腸68.37 IU、后腸52.42 IU，肝胰臟中顯著高于腸道中（P＜0.05）；中腸高于前腸，二者間無顯著差異（P＞0.05），中腸、前腸顯著大于后腸（P＜0.05）。不同部位同一溫度下比較，25℃及35℃時(shí)，肝胰臟、前腸、中腸高于后腸（P＜0.05）；30℃時(shí)各部位間無顯著差異（P＞0.05）；45℃、50℃時(shí)肝胰臟顯著高于前腸、中腸和后腸（P＜0.05），腸道各部位間無顯著差異（P＞0.05）。

圖2 不同溫度對(duì)翹嘴紅鲌腸和肝胰臟淀粉酶活性的影響Fig.2 Effects of different temperatures on amylase activities in intestine and hepatopancreas of Erythroculter ilishaeformis

圖3 不同溫度對(duì)翹嘴紅鲌腸和肝胰臟脂肪酶活性的影響Fig.3 Effects of different temperatures on lipase activities in intestine and hepatopancreas of Erythroculter ilishaeformis

在設(shè)定的25～50℃范圍內(nèi)，翹嘴紅鲌3 種酶的活性都是隨著溫度升高呈現(xiàn)先上升后下降。翹嘴紅鲌不同消化部位中蛋白酶活性的最適溫度均為45℃、脂肪酶均為40℃。淀粉酶活性在肝胰臟和腸道中的最適溫度不同，肝胰臟為30℃，而腸道為40℃。

2.2 pH 對(duì)翹嘴紅鲌3 種消化酶活性的影響

不同pH 條件下翹嘴紅鲌肝胰臟、前腸、中腸和后腸中3 種消化酶的活性見圖4～圖6。

由圖4 可知，翹嘴紅鲌不同部位蛋白酶活性隨pH 的變化基本一致，肝胰臟蛋白酶活性在pH7.4時(shí)達(dá)最大值188.17 IU，表現(xiàn)為pH7.4＞pH7.8＞pH7.0＞pH6.6＞pH6.2，pH7.4 顯著高于其他pH（P＜0.05），pH7.8、pH7.0 間無顯著差異（P＞0.05），pH7.8、pH7.0顯著高于pH 6.6（P＜0.05），pH6.6 顯著高于pH6.2（P＜0.05）。腸道蛋白酶活性在pH7.0 時(shí)最大，前腸、中腸、后腸分別為74.32 IU、70.50 IU 和85.13 IU，前腸pH7.0＞pH7.4、pH6.6＞pH7.8、pH6.2（P＜0.05），中 腸 和 后 腸pH7.0 ＞pH6.6、pH 7.4、pH7.8 ＞pH6.2（P＜0.05）。從不同部位蛋白酶活性最高值比較表明，肝胰臟中最高，顯著高于腸道各部位（P＜0.05），前腸和中腸相近，后腸大于前腸和中腸，3 段腸間差異不顯著（P＞0.05）。同一pH 不同部位蛋白酶活性的差異與此一致。

圖4 不同pH 對(duì)翹嘴紅鲌腸和肝胰臟蛋白酶活性的影響Fig.4 Effects of different pH values on protease activities in intestine and hepatopancreas of Erythroculter ilishaeformis

由圖5 可知，不同部位淀粉酶最適pH 均為7.0，其肝胰臟、前腸、中腸及后腸淀粉酶活性最高值分別為206.24 IU、107.32 IU、59.48 IU 和93.04 IU，肝胰臟中活性最高，前腸＞后腸＞中腸，各部位間差異顯著（P＜0.05）。pH6.2、pH6.6 時(shí)肝胰臟顯著高于前腸（P＜0.05），前腸顯著高于中腸和后腸（P＜0.05），中腸和后腸間差異不顯著（P＞0.05）。pH7.4和pH7.8 時(shí)，從高到低依次為肝胰腺、前腸、后腸、中腸，其中，pH7.4 時(shí)，肝胰腺、前腸＞后腸＞中腸（P＜0.05）；pH7.8 時(shí)，肝胰腺與前腸間、后腸與中腸間差異不顯著（P＞0.05）。不同部位淀粉酶活性隨pH 的變化趨勢(shì)相同，均為先升后降。肝胰腺為pH7.0＞pH6.6 ＞pH7.4 ＞pH6.2（P ＜0.05），pH6.2 ＞pH7.8（P＞0.05）；前腸為pH7.0＞pH7.4＞pH6.6、pH7.8＞pH6.2（P＜0.05）；中腸pH7.0 顯著高于其他pH（P＜0.05），其他pH 間無顯著差異（P＞0.05）；后腸pH7.0＞pH7.8＞pH6.6、pH7.8、pH6.2（P＜0.05），pH6.6、pH 7.8、pH6.2 間差異不顯著（P＞0.05）。

圖5 不同pH 對(duì)翹嘴紅鲌腸和肝胰臟淀粉酶活性的影響Fig.5 Effects of different pH values on amylase activities in intestine and hepatopancreas of Erythroculter ilishaeformis

由圖6 可知，不同部位脂肪酶活性均在pH7.4時(shí)最高，肝胰臟、前腸、中腸及后腸分別為57.02 IU、17.35 IU、61.43 IU 和34.33 IU，中腸最高，肝胰臟次之，二者間差異不顯著（P＞0.05），前腸和后腸較低，后腸高于前腸（P＜0.05），肝胰臟和中腸高于前腸和中腸（P＜0.05）。不同部位脂肪酶隨pH 變化的趨勢(shì)與蛋白酶及淀粉酶相似。肝胰腺pH7.4＞pH7.0、pH 7.8＞pH6.6＞pH6.2（P＜0.05），前腸pH7.4＞pH 7.0＞pH6.6＞pH7.8＞pH6.2（P＜0.05），中腸pH7.4＞pH7.0、pH7.8＞pH6.6＞pH6.2（P＜0.05），后腸pH7.4＞pH7.0＞pH6.6＞pH6.2、pH7.8（P＜0.05）。

圖6 不同pH 對(duì)翹嘴紅鲌腸和肝胰臟脂肪酶活性的影響Fig.6 Effects of different pH values on lipase activities in intestine and hepatopancreas of Erythroculter ilishaeformis

在設(shè)定的pH 范圍內(nèi)，最適合翹嘴紅鲌肝胰臟、腸蛋白酶活性的pH 分別為7.4 和7.0，最適肝胰臟和腸道淀粉酶活性的pH 為7.0、脂肪酶pH7.4。

3 討論

3.1 消化酶與魚類食性的關(guān)系

魚類的食性與消化生理密切相關(guān)，其消化道結(jié)構(gòu)和消化能力與食性相適應(yīng)[14]。正常情況下，肉食性和植食性魚類的消化道結(jié)構(gòu)和能力有顯著差異，肉食性魚類消化道長(zhǎng)度較植食性魚類短，需高蛋白食物，所以肉食性魚類的消化道中蛋白酶活性高，而植食性魚類需纖維素含量較高的食物，所以消化道的淀粉酶活性比較高[14]。韓慶等[19]研究洞庭湖鲇Silurus asotus 消化道各部位蛋白酶活性由高到低依次為：前腸、肝胰臟、中腸和后腸。本研究中翹嘴紅鲌消化道各部位蛋白酶活性由高到低依次為：肝胰臟、前腸、中腸、后腸，與洞庭湖鲇稍有不同，其原因可能是鲇為有胃魚類，肝胰臟分泌的為蛋白酶原，需激活才能具有酶活，因此活力弱，而較前腸低。本試驗(yàn)中翹嘴紅鲌蛋白酶活性的變化趨勢(shì)與公子小丑魚Amphiprion ocellaris[12]、嘉陵江鲇[13,14]、駝背鱸Chromileptes altivelis[20]等肉食性魚類相似，蛋白質(zhì)主要在前腸和肝胰臟中消化，說明翹嘴紅鲌為偏肉食性魚類。在翹嘴紅鲌養(yǎng)殖中，應(yīng)適當(dāng)提高餌料中蛋白質(zhì)含量，以滿足其對(duì)蛋白質(zhì)的需要，從而促進(jìn)翹嘴紅鲌的生長(zhǎng)，提高生產(chǎn)效益。

3.2 翹嘴紅鲌消化酶與其他魚類消化酶的比較

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，翹嘴紅鲌不同消化部位中蛋白酶活性的最適溫度均為45℃，脂肪酶均為40℃，淀粉酶肝胰臟為30℃而腸道為40℃；蛋白酶活性肝胰臟的最適pH 7.4、腸道最適pH7.0，淀粉酶活性最適pH 7.0，脂肪酶活性的最適pH 7.4。翹嘴紅鲌各消化酶活性隨溫度和pH 的變化與公子小丑魚[12]、嘉陵江鲇[13,14]、洞庭鲇[19]和駝背鱸[20]相近。楊婳等[21]研究黃金鱸Perca flavescens 消化酶活力的結(jié)果顯示：黃金鱸腸道蛋白酶活性的最適溫度為50℃，本研究中翹嘴紅鲌腸道蛋白酶活性的最適溫度為45℃，較黃金鱸低5℃，可能是因?yàn)辄S金鱸是熱帶魚類，更適應(yīng)于高溫環(huán)境。翹嘴紅鲌各部位消化酶活性最適溫度比一般水溫要高，在養(yǎng)殖中可適當(dāng)提高翹嘴紅鲌的生活水溫，有利于對(duì)各種食物的消化，提高產(chǎn)量。各部位消化酶活性最適pH 均為中性偏堿，其中脂肪酶活性及肝胰臟蛋白酶活性的最適pH7.4 偏堿性，這與翹嘴紅鲌長(zhǎng)期生活在弱堿性水域環(huán)境中相適應(yīng)，在養(yǎng)殖中應(yīng)控制水體pH7.0～7.4，以有利于其消化酶發(fā)揮作用，提高食物轉(zhuǎn)化率。