復(fù)方中草藥對虹鱒生長和非特異性免疫功能的影響

王凡，李聰歌，馬雅雯，劉飛，鄭雅婷，葛曉源，李菁祎，張明遠(yuǎn)，牛藝霖，孟祥杰

（洛陽師范學(xué)院，河南 洛陽 471934）

虹鱒Oncorhynchus mykiss 肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、營養(yǎng)成分豐富，幾乎不含膽固醇，具有加速病人傷口愈合、幫助術(shù)后患者身體恢復(fù)等優(yōu)點[2]，是我國備受歡迎的主要的淡水冷水性養(yǎng)殖魚類之一[1]。隨著市場需求量的增大，高密度集約化人工養(yǎng)殖迅速興起，而這種養(yǎng)殖模式易引起不同類型病原微生物疾病[3]。目前，最為有效的病害防治方式是使用抗生素?？股夭粫凰飶氐孜眨ㄟ^食物鏈進(jìn)入人體或者通過代謝進(jìn)入水環(huán)境，威脅人類健康，污染水環(huán)境[4]。

中草藥具有促生長、無藥物殘留、增強機體免疫、來源廣泛等獨特優(yōu)勢，通常被稱為“天然抗生素”，作為添加劑應(yīng)用到飼料產(chǎn)業(yè)上具有廣闊的前景。魚類養(yǎng)殖中應(yīng)用中草藥不僅能夠預(yù)防治療疾病，還能夠保證水產(chǎn)品的質(zhì)量安全。復(fù)方中草藥把各種單一的不同中草藥的藥效有效結(jié)合起來，使預(yù)防和治療發(fā)揮到最大效果[5]。研究表明，復(fù)方中草藥添加劑能夠促進(jìn)魚類生長、調(diào)控免疫力和抗病力[6-8]。

紅棗、山藥和黃芪是我國常見食用兼藥用的中藥藥材。紅棗在提高體內(nèi)單核細(xì)胞吞噬功能的同時，還能保護肝臟、增強體力[9]；黃芪能夠提高魚類生長性能、免疫力和抗病毒等[10]；山藥可以通過多方面來調(diào)節(jié)黃河鯉Cyprinus carpio 的免疫能力[11]。因此，本實驗通過研究上述復(fù)合物添加劑對虹鱒生長和非特異性免疫相關(guān)指標(biāo)的影響，旨在探討復(fù)方中草藥對虹鱒生長性能的影響和免疫調(diào)控的分子機制，為復(fù)方中草藥在虹鱒養(yǎng)殖中合理應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗飼料

將20∶1 的紅棗、黃芪和山藥提取物（購自陜西森弗天然制品有限公司，每1000 g 的原材料提取出50 g 的產(chǎn)品，經(jīng)過原料精選、粉碎、精細(xì)提取、過濾、濃縮、精制純化、干燥、精微粉碎幾個步驟）等比例混合成復(fù)合物，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%（對照組）、0.3%、0.6%和1.2%的比例加入到虹鱒基礎(chǔ)飼料的配方中制成復(fù)合中草藥飼料（表1），基礎(chǔ)飼料中不含復(fù)方中草藥，由此得到4 種實驗飼料。稱取飼料原料后粉碎，混勻后使用ZL-600 顆粒機制作直徑1.5 mm 顆粒飼料，經(jīng)24 h 陰干后放入-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 虹鱒基礎(chǔ)飼料配方Tab.1 Ingredient of basic feed in rainbow trout

1.1.2 實驗動物

虹鱒購自四川省眉山市東坡區(qū)天貴水產(chǎn)養(yǎng)殖場，體長7.6～8.9 cm，于冷水魚循環(huán)系統(tǒng)中的飼養(yǎng)缸（直徑×高=1 m×1 m）中用基礎(chǔ)飼料暫養(yǎng)14 d。冷水魚循環(huán)系統(tǒng)實時監(jiān)測水溫、pH 和溶氧（DO）含量，每天定時、定點投餌3 次，記錄投飼量及殘餌量。暫養(yǎng)期間水溫為11～15℃，pH（7.0±0.2），DO＞8 mg/L[12]。

1.2 方法

1.2.1 實驗設(shè)計

取暫養(yǎng)后體態(tài)均勻、規(guī)格基本一致的健康虹鱒幼魚分為4 組：對照組和3 組復(fù)合中草藥組，即分別投喂含復(fù)方中草藥0.3%、0.6%和1.2%的飼料，對照組投喂基礎(chǔ)飼料。各組設(shè)3 個平行，每個平行放魚30 尾，養(yǎng)殖56 d。按照魚體質(zhì)量的3%～4%投喂。試驗開始前，每缸整體稱重，實驗過程中環(huán)境和飼料管理條件同暫養(yǎng)期。

1.2.2 樣品的制備

投喂實驗結(jié)束時，禁食24 h，每缸魚整體稱重，計算增重率和特定生長率。然后每個實驗組取6 尾（每缸取2 尾）測量體長及體質(zhì)量，用酒精棉將魚體消毒，再用已經(jīng)消毒處理過的注射器自尾靜脈取血，置于離心管中，在室溫下放置1 h，置于4℃冰箱中過夜，3 500 r/min 離心15 min，制得血清[12]。同時，解剖取脾臟和肝臟裝在離心管中，稱量肝臟和脾臟重量，計算肝臟和脾臟指數(shù)，然后把肝臟、脾臟和血清一起放置-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

增重率（WGR）（%）=100×（終末體質(zhì)量-初始體質(zhì)量）/初始體質(zhì)量；

特定生長率（SGR）（%/d）=100×（ln 終末體質(zhì)量-ln 初始體質(zhì)量）/試驗天數(shù)；

肝臟指數(shù)（LSI）（%）=（肝臟濕重/魚體質(zhì)量）×100；

脾臟指數(shù)（SSI）（%）=（脾臟濕重/魚體質(zhì)量）×100。

1.2.3 血清抗菌活力（AA）的測定[12]

將活化后的大腸桿菌（購自中國微生物菌種保藏中心）接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基內(nèi)，在搖床中37℃震蕩培養(yǎng)48 h，然后用0.1 mol/L、pH6.4的PBS 緩沖液洗滌2 次后，將大腸桿菌配成A570=0.3～0.5 的懸液。取300 μL 該懸液于96 孔酶標(biāo)板孔內(nèi)，冰浴，加入5 μL 待測上述血清樣品，混勻，在酶標(biāo)儀中570 nm 下測A0，然后將酶標(biāo)板移入37℃恒溫培養(yǎng)箱中放置30 min，取出后置冰浴中10 min 以終止反應(yīng)，于酶標(biāo)儀570 nm 下測吸光度（A）。

1.2.4 血清其他生化指標(biāo)的測定

血清中溶菌酶（LYZ）性根據(jù)比濁法測定；總蛋白（TP）含量采用BCA 法測定，酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）活性和尿素氮（BUN）和肌酐（CREA）含量均采用微量酶板法測定（南京建成生物工程研究所）。超氧化化物歧化酶（SOD）采用WST-8 法進(jìn)行測定，其試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司。

血清中的補體3（C3）、補體4（C4）、腫瘤壞死因子（TNF-α）和白介素6（IL-6）含量采用酶聯(lián)免疫（ELISA）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）和酶標(biāo)儀進(jìn)行測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）”表示采用SPSS 13.0 進(jìn)行單因素方差分析，并利用Dunnett’s 法檢驗對照組與飼料添加劑組之間的差異，P＜0.05 表示該添加劑組與對照組差異顯著，P＜0.01 表示該組與對照組差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)方中草藥添加劑對虹鱒生長和肝、脾臟指數(shù)的影響

由表2 可知，飼料中添加復(fù)方中草藥組虹鱒的WGR 和SGR 有增大的趨勢，但與對照組無顯著差異（P＞0.05），對虹鱒的LSI 影響也不顯著（P＞0.05）。飼料中添加0.6%的復(fù)方中草藥時，虹鱒的SSI 顯著性升高了0.21 倍（P＜0.05）。

2.2 復(fù)方中草藥添加劑對虹鱒血清LYZ、AA 和SOD 活力的影響

與對照組相比較，復(fù)方中草藥組虹鱒的LYZ、AA 和SOD 活力升高（表3），其中SOD 酶活力極顯著升高（P＜0.01），且升高了1.02、3.15 和1.75 倍；0.3%和0.6%復(fù)方中草藥的組LYZ 活力顯著升高（P＜0.05），且依次升高了0.29 和0.24 倍；而0.6%和1.2%復(fù)方中草藥組AA 與對照組相比較有升高，但差異不顯著（P＞0.05）。

2.3 復(fù)方中草藥添加劑對虹鱒的肝腎功能的影響

與對照組相比，復(fù)方中草藥組的BUN、CREA含量和GPT、ALP 活性有降低趨勢，GOT、ACP 活性和TP 含量有升高趨勢（表4），其中CREA 含量和ALP 活性極顯著降低（P＜0.01），依次降低了21.49%、47.26%、39.61%和41.25%、43.95%、51.73%；0.6%復(fù)方中草藥組的BUN 極顯著降低（P＜0.01），降低了26.10%；而0.6%和1.2%的復(fù)方中草藥組的GPT 活性稍低于對照組，但差異不顯著（P＞0.05），各劑量組的GOT 活性高于對照組水平，但差異不顯著（P＞0.05）。復(fù)方中草藥組的ACP 顯著高于對照組，依次增高了0.67、1.49 和1.49 倍，0.6%和1.2%組的TP也顯著高于對照組，依次增高了0.54 和0.74 倍。

2.4 復(fù)方中草藥添加劑對虹鱒血清補體及細(xì)胞因子的影響

復(fù)方中草藥對虹鱒血清的補體及細(xì)胞因子含量的影響見表5。由表5 可知：除了IL-6 之外，與對照組相比較，各濃度組都呈升高趨勢，其中在0.6%組C3 和C4 含量極顯著升高（P＜0.01），依次升高了0.79 和1.62 倍；0.3%和0.6%組TNAF-α 都呈顯著性升高（P＜0.05，P＜0.01），依次升高了1.09 和1.70倍，而0.6%組和對照組IL-6 含量有輕微升高，但差異不顯著（P＞0.05）。

表3 復(fù)方中草藥對虹鱒血清LYZ、AA 和SOD 活力的影響Tab.3 Effects of Chinese herbal compound on LZM,AA and SOD activities in the serum of rainbow trout

表4 復(fù)方中草藥添加劑對虹鱒肝腎功能的影響Tab.4 Effect of Chinese herbal compound on liver and kidney functions in the serum of rainbow trout

表5 復(fù)方中草藥添加劑對虹鱒血清補體及細(xì)胞因子的影響Tab.5 Effect of Chinese herbal compound on complement and cytokines in the serum of rainbow trout

3 討論

3.1 復(fù)方中草藥添加劑對虹鱒生長、免疫器官指數(shù)和血清肝、腎功能的影響

中草藥作為飼料添加劑在魚類中應(yīng)用的研究表明，黃芪和含有黃芪的復(fù)方中草藥較好地提高了一些魚類的生長性能[8,10-13]。也有研究發(fā)現(xiàn)，含有黃芪的復(fù)方中草藥對大菱鲆Scophthalmus maximus 幼魚生長性能無顯著影響[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，含有山藥、紅棗和黃芪提取物的復(fù)方中草藥具有潛在的提高虹鱒生長的趨勢，但與對照組差異不顯著。

脾臟和肝臟中的淋巴組織是魚類重要的免疫器官之一。中草藥能加速免疫細(xì)胞的增殖、分化和成熟，促進(jìn)免疫器官的發(fā)育，提高免疫活性。王宏權(quán)等[14]研究表明，0.1%牛膝多糖能顯著提高草魚Ctenopharyngodon idellus 脾臟的臟器指數(shù)；較高劑量組的黃芪多糖可以明顯提高羅非魚Oreochromis mossambicus 的免疫器官指數(shù)[15]。本研究中，復(fù)方中草藥對虹鱒的肝臟指數(shù)影響不顯著，0.6%添加劑組顯著提高了虹鱒的脾臟指數(shù)，這說明基礎(chǔ)飼料中添加含有紅棗、山藥和黃芪提取物的復(fù)方中草藥可以提高虹鱒脾臟的生長發(fā)育及其免疫功能。

肝腎功能指標(biāo)常被用來評價動物的健康、營養(yǎng)和對環(huán)境的適應(yīng)情況。BUN 和CREA 常是衡量腎功能的兩種主要指標(biāo)，它們在某種程度上反映了腎小球的濾過功能[12]。本研究中，復(fù)方中草藥能使虹鱒血清BUN 和CREA 含量降低，使CREA 含量極顯著降低，這表明含有紅棗、山藥和黃芪提取物的復(fù)方種草藥添加劑增強了虹鱒腎臟的機能。GPT 和GOT 通常是衡量肝功能的常用生化指標(biāo)，肝細(xì)胞受到損傷時，它們通常會升高。本研究中，復(fù)方中草藥添加劑對GPT 和GOT 活性影響不顯著，這表明含有紅棗、山藥和黃芪提取物的復(fù)方中草藥對虹鱒的肝功能影響不顯著。血清中TP 的含量是機體吸收、合成和分解蛋白質(zhì)的一個標(biāo)志性指標(biāo)，也是機體免疫水平的間接反應(yīng)[14]。ACP 和ALP 是動物溶酶體酶的重要組成部分，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。ACP被認(rèn)為是高等動物體內(nèi)巨噬細(xì)胞溶酶體的標(biāo)志酶，直接用于磷酸基團的轉(zhuǎn)移，參與能量的轉(zhuǎn)化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，有助于磷酸二腺苷和磷酸三腺苷的合成，提高機體的非特異性免疫水平和營養(yǎng)代謝水平[16]。ALP 是一種重要的代謝調(diào)控酶，在堿性介質(zhì)中可通過水解作用將表面帶有磷酸酯的異物清除掉，同時參與鈣、磷的代謝營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用，其活性的高低與動物的生長性能關(guān)系密切[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方中草藥提高了虹鱒血清中TP 含量和ACP活性，而降低了ALP 活性，表明含有紅棗、山藥和黃芪提取物的復(fù)方中草藥通過提高血清TP 含量和ACP 活性增強了虹鱒的免疫機能。崔曉翠等[18]研究發(fā)現(xiàn)，檳榔、川楝子復(fù)方中草藥既能提高大黃魚Larimichthys crocea 血清中ACP 的含量，也能提高ALP 的含量。李思明等[19]研究蘆筍、薄荷葉等復(fù)方種草藥也能夠同時提高中華絨螯蟹Eriocheir Sinensis 血清中ACP 和ALP 的含量。路晶晶等[7]研究發(fā)現(xiàn)，含有黃芪的復(fù)方中草藥顯著降低了大菱鲆血清中ALP 的含量。以上研究表明，不同的復(fù)方中草藥對水生動物的ALP 的影響機制不一樣，黃芪可能在對ALP 的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。復(fù)方中草藥通過ALP 來調(diào)控魚類免疫的機制還有待進(jìn)一步去探討。

3.2 復(fù)方中草藥添加劑對虹鱒非特異性免疫指標(biāo)的影響

LZM可以溶解細(xì)菌的細(xì)胞壁，調(diào)節(jié)其他免疫因子的合成與分泌，也能促進(jìn)動物體內(nèi)有益菌增殖。它的活性和抗菌活力直接關(guān)系到魚類的免疫與健康[20]。SOD 是機體內(nèi)天然存在的一種清除超氧自由基的抗氧化酶，其活性與生物的免疫水平密切相關(guān)[12]。本研究中，復(fù)方中草藥能使虹鱒血清的LZM和SOD顯著升高，0.6%和1.2%復(fù)方中草藥組抗菌活力也略高于對照組。張意敏等[6]發(fā)現(xiàn)，含有黃芪的復(fù)方中草藥能夠顯著提高羅非魚血清的LZM 和SOD 活力。這表明復(fù)方中草促進(jìn)了LZM和SOD 的生物合成，提高了魚體的LZM和SOD 活力，增強了魚體的抗病力與免疫力。

補體系統(tǒng)在先天性免疫中具有趨化、調(diào)理和消滅病原體的作用[21-23]。C3 和C4 是補體系統(tǒng)中重要的分子，C3 在補體系統(tǒng)中比例最高。C3 和C4 在機體防御中通過免疫復(fù)合物、調(diào)節(jié)吞噬細(xì)胞等清除病原微生物，活化炎癥細(xì)胞[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方中草藥組虹鱒血清C3 和C4 含量有升高的趨勢，0.6%劑量組升高顯著，提高了虹鱒的免疫力和抗病力。陳成勛等[25]發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可以提高石斑魚Epinephelus malabaricus 血清的C3 和C4 含量。Musthaf 等[26]發(fā)現(xiàn)，添加一定劑量南瓜子喂養(yǎng)莫桑比克羅非魚Oreochromis mossambicus 4 周，補體活性顯著增高。這些研究進(jìn)一步說明了中草藥通過增加補體的表達(dá)與分泌而明顯促進(jìn)魚類先天免疫反應(yīng)。

魚類體內(nèi)大部分細(xì)胞因子，特別是促炎細(xì)胞因子（包括TNF-α 和IL-6 等），都與細(xì)菌、病毒、炎癥或細(xì)胞增殖以及趨化作用有關(guān)。TNF-α 是巨噬細(xì)胞受到病原體等有害刺激產(chǎn)生的一種小分子蛋白。它能直接殺傷腫瘤細(xì)胞，而對正常細(xì)胞無明顯毒性，是炎癥反應(yīng)必須的介質(zhì)和多效性的免疫調(diào)節(jié)因子[24]。機體中有足夠的IL-6 可以提高自身免疫功能[25]。本研究中，0.3%和0.6%的復(fù)方添加劑組可以顯著提高虹鱒血清中的TNAF-α 水平。0.6%復(fù)方添加劑也使血清中的IL-6 水平有小幅度提高。這些結(jié)果表明復(fù)方中草藥促進(jìn)促了炎癥因子表達(dá)與分泌，增強了虹鱒的免疫功能。

3.3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，在虹鱒飼料中添加適量的復(fù)方中草藥添加劑（20∶1 的紅棗、山藥和黃芪的提取物等比例混合），可以促進(jìn)脾臟的生長發(fā)育，提高虹鱒血清TP、C3、C4 和TNF-α 的含量及SOD、LZM和ACP 活性，提高虹鱒的免疫功能。建議虹鱒飼料的復(fù)方中草藥的添加水平為0.6%。