QuEChERS-SPE-高效液相色譜法測(cè)定飼料中乙氧酰胺苯甲酯的含量

宋 榮， 索德成， 李麗蓓， 范 理

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，北京100081）

乙氧酰胺苯甲酯是一種與鹽酸氨丙啉、 磺胺喹噁啉等抗球蟲藥配伍使用的球蟲抑制藥物，自身具有抗原蟲活性， 通過(guò)阻斷四氫葉酸的合成阻止裂殖體的正常發(fā)育而發(fā)揮作用， 對(duì)巨型艾氏球蟲和布氏艾氏球蟲以及其他小腸球蟲具有較好的抗蟲活性（丁佳雯等，2004）。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部允許使用的飼料藥物添加劑品種目錄中規(guī)定了含乙氧酰胺苯甲酯的藥物預(yù)混劑的使用規(guī)范。

乙氧酰胺苯甲酯檢測(cè)方法有分光光度法、氣相色譜法、高效液相色譜法等（王淑芬等，1997；Ishiguro 等，1991；Robert 等，1978；Leonard 等，1977）。 由于氣相色譜法需要在測(cè)定前將乙氧酰胺苯甲酯進(jìn)行衍生，方法繁瑣，所以飼料中乙氧酰胺苯甲酯的檢測(cè)分析多采用液相色譜法（劉發(fā)全等，2019）。飼料中乙氧酰胺苯甲酯的凈化方法包括液液分配、 溶劑轉(zhuǎn)換或固相萃取方法等，由于液液分配方法有機(jī)溶劑量較大、 操作復(fù)雜，溶劑轉(zhuǎn)換方法適合于簡(jiǎn)單基質(zhì)凈化，因此，目前復(fù)雜基質(zhì)的凈化多采用固相萃取柱（SPE）凈化，填料有中性氧化鋁 （Hibino 等，2000；Hikichi 等，1995；Hikichi 等，1993；Ishiguro 等，1981；Leonard等，1977）、堿性氧化鋁（Dousa 等，2001）、弗羅里硅土（Hikichi 等，1993）等，這些固相萃取柱可去除樣品中極性雜質(zhì)。 QuEChERS 是一種用于農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)的快速樣品前處理技術(shù)，利用吸附劑填料與基質(zhì)中雜質(zhì)的相互作用達(dá)到去除雜質(zhì)凈化樣品的目的。本文采用QuEChERS 技術(shù)結(jié)合中性氧化鋁固相柱凈化方法， 有效去除飼料中極性、非極性、離子態(tài)等多種雜質(zhì)，旨在提高凈化效果，降低色譜響應(yīng)本底，提高飼料中乙氧酰胺苯甲酯檢測(cè)靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 乙氧酰胺苯甲酯 （純度≧99.5%），中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；甲醇、正己烷、乙腈、丙酮（色譜純），F(xiàn)isher 公司；乙腈、無(wú)水硫酸鎂、氯化鈉（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙二胺-N-丙基吸附劑（PSA，粒徑40 μm）、十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18，粒徑40 μm）、中性氧化鋁固相萃取柱（1000 mg/6 mL），美國(guó)Agilent公司；QuEChERS 鹽析劑制備：4 g 無(wú)水硫酸鎂，1 g氯化鈉， 混合均勻；QuEChERS 凈化劑制備：0.5 g無(wú)水硫酸鎂，0.8 g 乙二胺-N-丙基吸附劑，0.6 g十八烷基鍵合硅膠吸附劑，混合均勻。

1.2 儀器與設(shè)備 1100 型高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent 公司；3K15 型離心機(jī)， 美國(guó)Sigma 公司；BS224S 型電子天平，德國(guó)賽多利斯公司；GenPure UV-TOC 型高純水發(fā)生器，美國(guó)賽默飛世爾公司；SK7200LHC 型超聲波清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；Vortex TM-1 型渦旋振蕩器， 德國(guó)WIGGENS 公司；24 孔固相萃取裝置，美國(guó)Supelco 公司；MG-2200 型氮?dú)獯蹈蓛x（帶加熱裝置），溫 度 可 控 制 在 （50 ±2）℃， 日 本 TOKYO RIKAKIKAI 公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液 稱取10 mg 乙氧酰胺苯甲酯標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇（色譜純）配制成濃度為100 μg/mL的乙氧酰胺苯甲酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，2 ～8 ℃保存，有效期為2 個(gè)月。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液 準(zhǔn)確吸取適量乙氧酰胺苯甲酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用甲醇（色譜純）配制成濃度為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0 μg/mL 乙氧酰胺苯甲酯標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4 試樣溶液制備 稱取適量樣品 （配合飼料、精料補(bǔ)充料、濃縮飼料約2 ～3 g，預(yù)混合飼料約0.5 ～1 g）， 精確至0.0001 g， 置于50 mL 離心管中，加約等量的水潤(rùn)濕樣品，準(zhǔn)確加入20 mL 乙腈，振搖混勻，超聲提取30 min，期間振搖數(shù)次。超聲后加入5 g QuEChERS 鹽析劑，混勻，靜置片刻，10000 r/min 離心10 min； 移取8 mL 上清液，加入1.9 g QuEChERS 凈化劑，混勻1 min，4000 r/min 離心10 min； 準(zhǔn)確移取5 mL 上清液，（50±2）℃氮?dú)獯蹈桑? mL 正己烷（色譜純）+丙酮（色譜純）= 95+5 溶液溶解， 該溶液全部通過(guò)用10 mL正己烷（色譜純）已活化好的中性氧化鋁固相萃取柱，5 mL 正己烷（色譜純）淋洗，抽干，6 mL 甲醇（色譜純）洗脫。收集洗脫液，將洗脫液（50±2）℃氮?dú)獯蹈伞?準(zhǔn)確加入1 mL 甲醇（色譜純）溶解，用0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾后，供高效液相色譜分析。1.5 液相色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18 柱，長(zhǎng)度250 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒徑5 μm；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：乙腈+水=3+7；流速：1.0 mL/min；激發(fā)波長(zhǎng)：306 nm，發(fā)射波長(zhǎng)：350 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇 飼料中乙氧酰胺苯甲酯提取溶劑主要有水、 甲醇（或） 乙腈及其混合溶液。Leonard 等（1977）發(fā)現(xiàn)，提取液中水的比例控制在20%以內(nèi)可以減少干擾色譜的共提取物。 本實(shí)驗(yàn)比較了80%甲醇、 甲醇和乙腈對(duì)添加8 mg/kg 乙氧酰胺苯甲酯的肉雞配合飼料的提取效率，結(jié)果見圖1。

圖1 三種提取溶液對(duì)雞配合飼料中乙氧酰胺苯甲酯的提取回收率（n=3）

圖1 表明，80%甲醇、甲醇和乙腈3 種提取溶液對(duì)含8 mg/kg 乙氧酰胺苯甲酯的肉雞配合飼料的提取回收率分別為94%、89.3%和82.6%，80%甲醇提取效率高于甲醇，也高于乙腈，表明含一定比例水的提取液可有效提高提取效率。

2.2 樣品凈化方法的選擇和優(yōu)化

2.2.1 QuEChERS 凈化 水潤(rùn)濕飼料樣品在提高提取效率的同時(shí)會(huì)提取出共存雜質(zhì)， 從飼料基質(zhì)特點(diǎn)出發(fā)， 本實(shí)驗(yàn)采用QuEChERS 技術(shù)，對(duì)QuEChERS 凈化劑組成和用量進(jìn)行研究。 采用無(wú)水硫酸鎂去除水分，PSA 吸附劑去除陰離子雜質(zhì)，C18 吸附劑去除非極性雜質(zhì)， 并通過(guò)少量多次考量?jī)艋瘎┯昧俊?提取液中每加入0.2 g 吸附劑，混勻離心后觀察吸附劑層顏色的變化，PSA 吸附劑層因PSA 與陰離子雜質(zhì)結(jié)合而變成墨綠色，當(dāng)PSA 累計(jì)用量達(dá)到0.8 g 時(shí)，PSA 吸附劑層顏色不再變化，據(jù)此確定PSA 吸附劑用量為0.8 g。 采用同樣的方法，以C18 吸附劑層顏色不再變成黃色確定C18 吸附劑用量為0.6 g。

2.2.2 固相萃取柱凈化 對(duì)經(jīng)QuEChERS 凈化、氮吹濃縮，再次溶解后得到的溶液，比較使用或不使用中性氧化鋁固相萃取柱的凈化效果。 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不使用中性氧化鋁凈化的色譜本底明顯高于使用中性氧化鋁固相萃取柱的色譜本底。 同時(shí)比較了中性氧化鋁和強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱（MCX 柱）兩種固相萃取柱的凈化效果， 結(jié)果表明中性氧化鋁柱凈化后的色譜本底遠(yuǎn)低于MCX 凈化后的色譜本底，據(jù)此本實(shí)驗(yàn)采用QuEChERS 凈化劑結(jié)合中性氧化鋁固相萃取柱的凈化方式。 在確定了凈化方式后， 對(duì)中性氧化鋁固相萃取所用洗脫溶劑進(jìn)行研究，比較了甲醇和正己烷+丙酮（6+4）兩種洗脫溶劑對(duì)0.3 mg/kg 和0.6 mg/kg 兩個(gè)添加濃度樣品吸附在中性氧化鋁柱上的乙氧酰胺苯甲酯的洗脫能力，結(jié)果見圖2。

圖2 洗脫溶劑洗脫能力測(cè)定結(jié)果（n=4）

圖2 表明，甲醇和正己烷+丙酮（6+4）對(duì)中性氧化鋁柱上乙氧酰胺苯甲酯的洗脫能力存在差異，甲醇的洗脫效力高于正己烷+丙酮（6+4），由此本實(shí)驗(yàn)采用甲醇作為中性氧化鋁柱的洗脫溶液。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液線性和標(biāo)液穩(wěn)定性 乙氧酰胺苯甲酯標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，7 次測(cè)定峰面積見表1， 線性相關(guān)性見圖3。 表1 中乙氧酰胺苯甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度和色譜峰面積相關(guān)系數(shù)大于0.999。采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)直線擬合法對(duì)標(biāo)液穩(wěn)定性進(jìn)行考察，對(duì)7 次測(cè)定乙氧酰胺苯甲酯特征濃度（20 μg/mL）的色譜峰面積進(jìn)行線性擬合，所得斜率用t 檢驗(yàn)進(jìn)行考察 （計(jì)算公式見GB/T 15000.3-2008），前6 次測(cè)定的峰面積通過(guò)t 檢驗(yàn)，第7 次測(cè)定未通過(guò)檢驗(yàn)。 從而確定乙氧酰胺苯甲酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液有效期為2 個(gè)月。

2.4 方法適應(yīng)性 12 種動(dòng)物飼料中乙氧酰胺苯甲酯添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。 從表2 看出，畜禽動(dòng)物配合飼料、濃縮飼料、添加劑預(yù)混合飼料和反芻動(dòng)物精料補(bǔ)充料中乙氧酰胺苯甲酯添加回收率為80% ～120%，相對(duì)相差≤15%。

表1 乙氧酰胺苯甲酯標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

圖3 乙氧酰胺苯甲酯標(biāo)準(zhǔn)工作液線性相關(guān)圖

表2 方法適應(yīng)性考察實(shí)驗(yàn)（n=2）

2.5 方法回收率和精密度 在確定樣品前處理方法后，用各類空白飼料樣品做為測(cè)試對(duì)象，進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，以考察方法的回收率和精密度。4 種飼料中乙氧酰胺苯甲酯3 個(gè)濃度水平3 次測(cè)定的添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3， 平均回收率為89.9% ～ 102.9% ， 批內(nèi)變異系數(shù)為0.31% ～6.33%，批間變異系數(shù)為2.74% ～ 6.50%。4 種飼料的空白和添加樣品色譜圖見圖4。

樣品名稱添加濃度/（mg/kg）測(cè)定批次回收率/%1 2 3 4 5 6平均回收率/%批內(nèi)變異系數(shù)/%批間變異系數(shù)/%Ⅰ90.3 94.3 98.3 91.0 102.3 103.0 96.5 5.73 0.30 6.50肉雞配合飼料5.00 4.00 8.00ⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ106.3 106.3 99.7 88.3 91.7 87.7 94.8 96.0 96.0 101.6 101.8 98.4 101.4 101.4 101.2 90.8 92.0 91.9 97.0 97.6 97.4 95.9 102.3 101.0 99.7 96.7 91.2 98.6 100.8 91.5 97.6 104.0 104.3 95.3 101.9 90.7 90.3 90.9 91.6 92.0 93.6 98.8 101.2 100.1 102.8 102.8 101.7 91.3 91.0 91.4 97.6 97.9 97.5 98.8 99.4 100.2 4.34 3.54 2.40 1.62 0.84 0.52 0.31 2.84 4.26 92.0 94.5 95.5 99.5 98.0 97.0 96.1 2.78 20Ⅱ93.593.5 93.094.591.594.593.4 1.19 3.97Ⅲ 100.0 103.0 101.0 102.5 100.5 102.0 101.5 1.17Ⅰ 100.0 98.7 100.0 96.7 96.7 96.7 98.1 1.67肉雞濃縮飼料 30 Ⅱ 94.0 94.3 93.7 98.0 97.3 98.3 95.9 2.24 4.63Ⅲ87.3 87.3 92.7 98.3 99.0 86.0 91.8 6.33Ⅰ94.5 94.5 94.5 100.5 102.5 101.3 98.0 3.93 40Ⅱ92.592.5 98.892.598.8100.595.9 3.97 3.74Ⅲ92.8 95.5 92.8 99.0 101.0 99.5 96.8 3.68Ⅰ87.3 87.0 91.3 96.0 93.0 93.7 91.4 3.61 0.30Ⅱ100.7102.3 104.3102.7102.0100.7102.1 1.33 5.58Ⅲ91.3 95.0 97.7 99.7 98.0 102.7 97.4 4.02Ⅰ90.0 91.6 82.4 90.8 91.4 93.0 89.9 4.22奶牛精料補(bǔ)充料 5.00 Ⅱ 101.6 100.6 101.8 104.6 91.6 93.4 98.9 5.25 6.16Ⅲ99.0 93.4 101.4 100.2 99.6 102.0 99.3 3.10Ⅰ92.0 96.8 85.8 88.5 87.5 93.5 90.7 4.57 8.00Ⅱ100.4102.0 103.5101.8101.3104.1102.2 1.35 5.80Ⅲ98.1 99.0 100.6 101.4 99.5 100.3 99.8 1.19Ⅰ100 2.74產(chǎn)蛋雞預(yù)混合飼料200 4.99 500ⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ97.5 98.8 98.8 97.5 98.5 98.0 98.2 94.1 96.7 96.9 94.5 93.5 93.8 94.9 92.0 95.5 95.5 90.3 91.4 94.0 93.1 99.5 101.5 102.0 101.5 101.5 101.5 101.2 97.0 97.0 100.0 100.0 91.5 90.5 96.0 88.5 93.5 94.0 93.5 88.5 92.5 91.8 93.4 93.2 93.8 89.4 89.8 89.6 91.5 95.2 100.0 97.0 96.4 100.4 98.8 98.0 100.6 98.6 98.6 100.2 100.8 99.6 99.7 0.62 1.58 2.37 0.87 4.28 2.79 2.33 2.13 0.97 4.15

2.6 定量限 根據(jù)10 倍信噪比對(duì)應(yīng)的乙氧酰胺苯甲酯含量， 在以上4 種空白飼料樣品進(jìn)行添加回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明樣品中0.3 mg/kg 添加濃度回收率和精密度能達(dá)到定量要求， 所以本方法定量限為0.3 mg/kg。

3 結(jié)論

本文建立了水潤(rùn)濕，乙腈提取，QuEChERS 技術(shù)和中性氧化鋁固相萃取凈化， 熒光檢測(cè)器測(cè)定飼料中乙氧酰胺苯甲酯的高效液相色譜方法。 該方法適用于飼料復(fù)雜基質(zhì)的凈化， 方法各項(xiàng)性能指標(biāo)達(dá)到日常檢測(cè)分析的要求， 為飼料中乙氧酰胺苯甲酯使用的監(jiān)管提供檢測(cè)手段。

圖4 空白和添加樣品中乙氧酰胺苯甲酯的液相色譜圖