遺傳算法優(yōu)化超聲輔助低共熔溶劑提取紅棗總黃酮工藝研究

李 棟

（呂梁學(xué)院生命科學(xué)系，山西呂梁033000）

紅棗是鼠李科（Rhamnaceae）棗屬植物棗樹（Ziziphus jujuba Mill.）的成熟果實，在我國有著悠久的種植歷史。紅棗中富含黃酮、皂苷、色素、各種維生素和抗氧化酶等活性成分， 其中紅棗黃酮是紅棗中最重要的活性成分之一（吳添文，2015）。研究證實紅棗黃酮具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎和促進淋巴細胞增殖等功效（張硯壘等，2020）。紅棗中黃酮提取是紅棗產(chǎn)業(yè)中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。因此，尋找綠色高效提取技術(shù)從紅棗中提取黃酮是當(dāng)前研究的熱點。

目前， 從天然植物資源中提取活性成分通常采用常規(guī)溶劑（甲醇、乙醇、乙酸乙酯等），但這些溶劑易揮發(fā)，造成環(huán)境污染（Wang 等，2019）。 為克服傳統(tǒng)溶劑的缺陷，近年來低共熔溶劑（DESs）作為傳統(tǒng)溶劑的綠色替代品得到了廣泛的應(yīng)用。DESs 作為新一代的液體鹽， 通常是由氫鍵受體（HBA）和氫鍵供體（HBD）按照一定比例相互混合而制得。氯化膽堿通常作為HBA。葡萄糖、1，3-丁二醇、1，4-丁二醇、乙二醇和甘油通常作為HBD。自DESs 提出以來， 已成功應(yīng)用于酚酸 （周惠燕等，2019）、生物堿（Tan 等，2016）和多糖（熊蘇慧等，2018）的提取當(dāng)中。此外，綠色提取的另一個方式是通過使用潛在的創(chuàng)新技術(shù)（例如超聲）來降低能耗。利用超聲所產(chǎn)生的“機械效應(yīng)”、“空化效應(yīng)”和“熱效應(yīng)”，加速植物細胞壁的破裂，降低目標(biāo)成分由內(nèi)向外的傳遞阻力， 進而有效提高目標(biāo)成分得率（Zhang 等，2018）。 目前，利用超聲輔助低共熔溶劑提取紅棗總黃酮的研究鮮見報道。 除提取技術(shù)外， 紅棗總黃酮得率還取決于許多其他因素（萃取溫度、萃取時間、料液比和超聲功率）。因此，優(yōu)化紅棗總黃酮的提取條件是提高其得率的關(guān)鍵。 遺傳算法（GA）具有全局尋優(yōu)的特點，能取得較好的預(yù)測和優(yōu)化效果。目前，采用該方法對紅棗總黃酮的提取條件進行優(yōu)化的研究鮮見報道。 鑒于此， 本研究采用超聲輔助低共熔溶劑提取技術(shù)對紅棗總黃酮進行提取，探究含水量、超聲功率、提取時間、 提取溫度和料液比對紅棗總黃酮得率的影響，并通過GA 優(yōu)化其提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 紅棗，呂梁木棗；氯化膽堿，河北陌槿生物科技有限公司；1，4-丁二醇、1，3-丁二醇、丙三醇和乙二醇，蘇州市森菲達化工有限公司；亞硝酸鈉，常州市啟迪化工有限公司；硝酸鋁，上海金錦樂實業(yè)有限公司；氫氧化鈉，宜昌佳茂化工有限公司；葡萄糖，上海澄紹生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備 YM-1000CT 超聲波提取儀，上海豫明儀器有限公司；FA1004 分析天平， 紹興萬力儀器有限公司；UV759 紫外可見分光光度計， 青島聚創(chuàng)環(huán)保集團有限公司；TG18K-Ⅱ型高速離心機， 上海趙迪生物科技有限公司；FD-1A-50 真空冷凍干燥機，江蘇天翎儀器有限公司；JJ-2 植物粉碎機，常州市萬豐儀器制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理 將新鮮的紅棗用清水沖洗干凈，然后用刀子剔除棗核并切成絲狀，置于60 ℃干燥機中將其烘干，然后用植物粉碎機將其粉碎，過40 目篩，將制的紅棗粉末密封避光保存?zhèn)溆谩?.3.2 DESs 溶劑制備 不同種類DESs 溶劑可顯著影響黃酮提取效果， 因此在提取紅棗黃酮前首先要篩選合適的DESs 溶劑。 參考Wang 等（2019） 方法以氯化膽堿為HBA，1，4-丁二醇、1，3-丁二醇、丙三醇、乙二醇和葡萄糖為HBD。將兩者按照表1 中的摩爾比混合，在80 ℃恒溫水浴中攪拌至形成澄清的液體，即為制得DESs 溶劑。1.3.3 紅棗總黃酮提取 稱取10.00 g 紅棗粉末置于具塞三角瓶中， 按照一定料液比加入不同含水量的DESs 溶劑，用玻璃棒攪拌使其充分混合，將其置于超聲提取設(shè)備中，通過儀器控制面板，設(shè)置超聲功率、 超聲時間和超聲溫度， 待提取結(jié)束后，將提取物置于離心機中以7000 r/min 離心15 min，真空抽濾獲得濾液，殘渣重復(fù)上述操作，合并濾液，濾液即為總黃酮提取液。

1.3.4 總黃酮得率測定 利用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定紅棗總黃酮含量， 具體操作步驟參考孫平等（2020）測定野菊花總黃酮的步驟，不同提取條件下紅棗總黃酮得率的計算公式如下：

表1 不同類型DESs 溶劑

式中：Y 為總黃酮得率，mg/g；V0為定容后提取液的體積，mL；V1為樣品總體積，mL；V2為測定用體積，mL；c 為紅棗的質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.3.5 單因素試驗 選擇超聲輔助低共熔溶劑法作為紅棗總黃酮的提取方法， 操作同1.3.3。 以10.00 g 紅棗粉末為提取對象， 對含水量 （10%、20%、30%、40%、50%）、 超聲功率（100、150、200、250、300 W）、提取時間（10、20、30、40、50 min）、提取溫度（40、45、50、55、60 ℃）、料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL）5 個因素進行單因素試驗，討論試驗因素對樣品總黃酮得率的影響。

1.3.6 響應(yīng)面法試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以含水量（X1）、超聲功率（X2）、提取溫度（X3）和料液比（X4）為自變量，以總黃酮得率（Y）為響應(yīng)值。根據(jù)Design-Expert 8.0.6 中的Box-Behnken 試驗原理設(shè)計組合試驗，因素與水平設(shè)計如表2 所示。

表2 試驗設(shè)計因素與水平

采用響應(yīng)面分析法得到的二次回歸模型為：

式中：b0為截距回歸系數(shù)；bi為線性回歸系數(shù)；bii為二次項的回歸系數(shù)；bij為交互項的回歸系數(shù)；Xi，Xj為自變量。

1.3.7 遺傳算法設(shè)計 依據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取含水量（X1）、超聲功率（X2）、提取溫度（X3）和料液比（X4）4 個因素為決策變量，即：

X=X（X1， X2， X3， X4）；

如X（t）滿足式以下公式，表明迭代終止。

則最優(yōu)解，X*（t），對應(yīng)的Y*為最優(yōu)值，即為最佳的輸出向量。 此時紅棗總黃酮得率的目標(biāo)函數(shù)為：

式中：f（x）為RSM 模型得到的紅棗總黃酮得率的目標(biāo)函數(shù)；n 為自變量個數(shù)；XiL和XiU分別為X 的上限和下限。

遺傳算法優(yōu)化的約束條件：選擇各因素水平的上下限，總黃酮得率最優(yōu)的約束條件如下式所示：

1.4 數(shù)據(jù)處理 每組試驗重復(fù)3 次，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示；采用Statistix8.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析（ANOVA）；采用Matlab 2015b優(yōu)化超聲輔助低共熔溶劑提取紅棗總黃酮工藝參數(shù)；Design-Expert 8.0.6 設(shè)計組合試驗和利用Origin9.0 進行單因素繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同DESs 溶劑對紅棗總黃酮得率的影響不同類型DESs 溶劑具有不同導(dǎo)電性、密度、黏度和溶解度等物化參數(shù)， 這些參數(shù)均能影響目標(biāo)成分提取效果（Rois Mansur 等，2019）。 本研究以氯化膽堿作為氫鍵受體， 選用1，4-丁二醇、1，3-丁二醇、丙三醇、乙二醇和葡萄糖作為氫鍵供體，按照不同摩爾比進行充分混合制備不同種類的DESs 溶劑，其對紅棗總黃酮得率的影響結(jié)果如圖1 所示。

圖1 不同DESs 溶劑對紅棗總黃酮得率的影響

由圖1 可知， 不同類型的DESs 溶劑對紅棗總黃酮得率的影響大小順序為DESs-6>DESs-4=DESs-5>DESs-2>DESs-1=DESs-3>DESs-7=DESs-8>DESs-10>DESs-9。 其中采用DESs-6 作為溶劑所得紅棗總黃酮得率最大， 為 （26.52±0.28）mg/g。分析其原因可能是氯化膽堿與1，4-丁二醇混合制備的低共熔溶劑（DESs-6）與黃酮極性相似，使得總黃酮在溶劑中溶解度較大（Huang等，2019）；此外溶劑表面張力和黏度較低，易于黃酮從細胞內(nèi)擴散到溶劑中，增加總黃酮得率（Xiao等，1991）。 綜上，最終選擇DESs-6 作為紅棗總黃酮的最佳提取溶劑，用于后續(xù)試驗。

2.2 單因素對紅棗總黃酮得率的影響 單因素對紅棗總黃酮得率的影響結(jié)果如圖2 所示。 由圖2A 可知，當(dāng)含水量為10% ～ 30%時，紅棗總黃酮得率隨含水量增加呈現(xiàn)顯著增加的趨勢 （P <0.05）。 其原因是含水量增加可有效地減弱DESs的氫鍵和溶劑表面張力，造成溶劑黏度迅速下降，有利于提高黃酮的溶解度和傳質(zhì)速率， 進而使得總黃酮得率增加（Wang 等，2020）。 當(dāng)含水量超過30%，繼續(xù)增加溶劑中的水分含量紅棗總黃酮得率反而顯著降低（P<0.05）。 其原因是含水量增加使得溶液中的極性增強，不利于黃酮提取，因此總黃酮得率降低（Bi 等，2013）。 綜上， 選擇含水量為20%、30%和40%三個水平進行后續(xù)的組合試驗。

由圖2B 可知， 當(dāng)超聲功率為100 ～ 200 W時， 紅棗總黃酮得率隨超聲功率增加呈顯著增加的趨勢（P < 0.05）。 其原因是隨超聲功率增加，超聲產(chǎn)生的“空化效應(yīng)”破壞紅棗細胞壁程度增加，黃酮由內(nèi)向外的傳遞阻力明顯降低， 擴散系數(shù)和溶解速度均明顯增加有利于總黃酮的提取（張世奇等，2020）。當(dāng)超聲功率超過200 W，隨超聲功率增加總黃酮得率呈顯著降低的趨勢（P < 0.05）。其原因是高強度超聲功率會破壞黃酮結(jié)構(gòu)， 不利于黃酮提?。ㄚw強等，2020）。 綜合考慮，本試驗選擇超聲功率為100、150 W 和200 W 三個水平進行后續(xù)組合試驗。

由圖2C 可知，當(dāng)提取時間為10 ～ 30 min，隨提取時間延長紅棗總黃酮得率呈現(xiàn)顯著增加的趨勢（P < 0.05）。其原因是在提取初期，超聲“空化效應(yīng)” 促進總黃酮由內(nèi)向外擴散， 增加總黃酮得率（張世奇等，2020）。但當(dāng)提取時間超過30 min 時，由于大多數(shù)總黃酮已經(jīng)被溶出， 故總黃酮得率隨提取時間的延長無顯著變化（P < 0.05）。 綜合考慮，本試驗選擇提取時間為30 min，后續(xù)不再進行提取時間優(yōu)化。

由圖2D 可知， 當(dāng)提取溫度為40 ～ 50 ℃，隨提取溫度升高紅棗總黃酮得率顯著增加 （P <0.05），提取溫度為50 ℃時，總黃酮得率取得最大值（26.07±0.45）mg/g。這是由于隨溫度升高，黃酮溶解度和擴散系數(shù)增加，有利于總黃酮從細胞溶出，增加總黃酮得率（王昭珺等，2020）。但當(dāng)提取溫度超過50 ℃， 隨提取溫度升高總黃酮得率反而顯著降低（P < 0.05）。 其原因是高溫影響黃酮提?。ɑ舻と旱龋?014）。綜合考慮，本試驗選擇提取溫度為45、50 ℃和55 ℃三個水平進行后續(xù)組合試驗。

圖2 不同試驗因素對紅棗總黃酮得率的影響

由圖2E 可知，紅棗總黃酮得率隨料液比增加呈現(xiàn)先顯著增加后顯著降低的趨勢 （P <0.05），當(dāng)料液比為1∶25（g/mL）時，總黃酮得率取得最大值（27.19±0.29）mg/g。 其原因是隨溶劑增加，固液界面的濃度梯度增加，濃度梯度作為黃酮由內(nèi)向外的傳質(zhì)驅(qū)動力，驅(qū)動紅棗黃酮擴散，使得得率增加（張貞發(fā)等，2021）。 但如果溶劑過多，會造成大量雜質(zhì)溶劑；此外，還增加后期分離純化的成本（葉麗等，2020）。 綜上考慮，料液比選擇1∶20、1∶25 和1∶30（g/mL）三個水平進行后續(xù)組合試驗。

2.3 響應(yīng)曲面法試驗結(jié)果

2.3.1 模型建立與顯著性檢驗 通過遺傳算法優(yōu)化超聲輔助低共熔溶劑提取紅棗總黃酮的工藝，所得的試驗方案和結(jié)果見表3。以總黃酮得率（Y）為響應(yīng)值， 對試驗所得的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合分析，同時剔除不顯著項，得到紅棗總黃酮得率對含水量（X1）、超聲功率（X2）、提取溫度（X3）和料液比 （X4） 的回歸模型：Y=28.20+0.76X1+0.69X2+0.96X3+0.21X4+0.35X1X3-0.70X12-0.99X22-0.83X32-0.48X42。

對回歸方程系數(shù)進行顯著性檢驗， 結(jié)果如表4 所示。 由表4 可知， 數(shù)學(xué)模型決定系數(shù)R2=0.9749，F(xiàn)=38.85，P < 0.0001。 結(jié)果表明通過RSM建立的數(shù)學(xué)模型極顯著。 該模型失擬項P =0.1132>0.05，表明模型失擬項不顯著。 通過以上數(shù)據(jù)分析表明，通過RSM 所建立的數(shù)學(xué)模型對試驗數(shù)據(jù)擬合充分，可靠性較好。

利用F 值大小可以判斷試驗因素對響應(yīng)值的影響程度，F(xiàn) 值越大，說明該因素對響應(yīng)值的影響越顯著。 由表4 可知，F(xiàn) （X1）=99.63、F （X2）=102.04、F（X3）=187.53 和F（X4）=7.51，即各試驗因素對紅棗總黃酮得率的影響順序為提取溫度（X3）>超聲功率（X2）>含水量（X1）>料液比（X4），且含水量、 超聲功率和提取溫度對紅棗總黃酮得率的影響達到極顯著水平（P < 0.0001）。

表3 響應(yīng)曲面法試驗設(shè)計及結(jié)果

由圖3A 可知， 通過試驗測定的總黃酮得率的真實值與RSM 模型預(yù)測的總黃酮得率值基本一致。結(jié)果表明可以通過RSM 模型來預(yù)測不同提取條件下紅棗總黃酮得率。 由圖3B 可知，在本試驗中所得的總黃酮得率試驗值均遵循正態(tài)分布，且沒有偏離方差。 由圖3C 可知，所有試驗點的學(xué)生化外殘差范圍均在±3 內(nèi)。 此外，由圖3D 可知，多項式模型的Cook’s 距離均在1.0。 結(jié)果表明本試驗所得的總黃酮得率沒有異常值。 綜上進一步驗證采用RSM 模型預(yù)測不同提取條件下總黃酮得率是準(zhǔn)確可靠的。在此基礎(chǔ)上，進一步采用遺傳算法優(yōu)化超聲輔助低共熔溶劑提取紅棗總黃酮是合理可行的。

表4 紅棗總黃酮工藝優(yōu)化回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗報告

2.3.2 交互項分析 利用等高線圖形來判斷因素交互作用對響應(yīng)值的影響程度是否顯著。當(dāng)?shù)雀呔€圖形為橢圓時，代表因素交互作用顯著影響響應(yīng)值變化（張貞發(fā)等，2021）；當(dāng)?shù)雀呔€圖形為圓形時，代表因素交互作用對響應(yīng)值變化無顯著影響（李艷艷等，2020）。 由表4 方差分析結(jié)果可知，X1X2、X1X4、X2X3、X2X4和X3X4的 交 互 作 用 均對紅棗總黃酮得率無顯著影響（P > 0.05），故在此不做分析。X1X3的交互作用顯著影響紅棗總黃酮得率（P < 0.05）。由圖4 可知，紅棗總黃酮得率隨含水量增加和提取溫度升高均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢， 總黃酮得率在中心處取得極值點。并且等高線呈現(xiàn)橢圓型， 表明X1X3的交互作用顯著影響紅棗總黃酮得率。 綜上可知，對紅棗總黃酮得率影響因素順序為提取溫度（X3）>超聲功率（X2）>含水量（X1）>料液比（X4），該結(jié)果也與方差分析的結(jié)果一致。

圖3 模型充分性檢驗圖

2.3.3 紅棗總黃酮提取工藝參數(shù)優(yōu)化 利用Matlab R2018b 軟件中的遺傳算法優(yōu)化工具箱進行分析優(yōu)化，迭代71 次，紅棗總黃酮得率取得最大值，此時含水量（X1）、超聲功率（X2）、提取溫度（X3）和料液比（X4）水平編碼分別為0.726、0.348、0.731、0.219， 即試驗水平分別為37.26%、167.4 W、53.655 ℃和1∶26.095（g/mL），在此條件下，所得紅棗總黃酮得率理論值為28.97 mg/g。 遺傳算法M 文件運行結(jié)果如圖5 所示。

圖4 各試驗因素交互作用的響應(yīng)面和等高線圖

圖5 遺傳算法優(yōu)化結(jié)果

2.3.4 試驗驗證 為驗證遺傳算法的可靠性，結(jié)合實際情況， 將上述工藝參數(shù)修正為： 含水量37%、超聲功率167 W、提取溫度54 ℃和料液比1∶26（g/mL），按照上述因素水平進行三次重復(fù)試驗，所得紅棗總黃酮得率為（29.33±0.37）mg/g，試驗值和理論值的相對誤差為1.24%。 研究結(jié)果表明遺傳算法可較好地模擬和預(yù)測不同提取條件下紅棗總黃酮得率， 進一步證明利用該方法優(yōu)化超聲輔助低共熔溶劑提取紅棗總黃酮工藝參數(shù)是可行的。

3 結(jié)論

本研究通過遺傳算法優(yōu)化超聲輔助低共熔溶劑提取紅棗總黃酮工藝，得到最優(yōu)工藝參數(shù)為：含水量37%、超聲功率167 W、提取時間30 min、提取溫度54 ℃和料液比1∶26（g/mL）。 在此條件下，所得紅棗總黃酮得率為（29.33±0.37）mg/g。試驗值和理論值的相對誤差為1.24%。 表明遺傳算法可較好地模擬和預(yù)測紅棗總黃酮得率， 且優(yōu)化工藝參數(shù)是可行的。 研究結(jié)果為紅棗總黃酮提取提供了一種綠色高效的提取方法。