老化型C57BL/6J小鼠耳蝸外側(cè)壁血管紋Claudin-5、 NF-κB、P21的表達(dá)*

高險亭 盧嶺 梁耕田 陳應(yīng)超 吳龍軍

血管紋位于耳蝸中階外側(cè)壁,是維持耳蝸內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和內(nèi)淋巴電位的器官。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)淋巴平衡破壞可造成外毛細(xì)胞的凋亡[1]。血-迷路屏障結(jié)構(gòu)包括血管紋微血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、基膜、復(fù)雜的緊密連接和粘合連接，它們類似于細(xì)胞間信號傳導(dǎo)，能控制血管滲透性以及為聽功能提供適宜的環(huán)境[2]。在基因遺傳缺陷、各種炎癥刺激、氧化應(yīng)激、噪聲損傷以及衰老細(xì)胞凋亡的病理條件下，血-迷路屏障細(xì)胞間相互作用導(dǎo)致其通透性增加，內(nèi)外淋巴各種離子成分改變，耳蝸電位受影響，從而導(dǎo)致聽力障礙[3]。本研究擬通過觀察老化型C57BL/6J小鼠耳蝸外側(cè)壁血管紋緊密連接蛋白(Claudin-5)、核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)、細(xì)胞周期抑制蛋白(P21)的表達(dá)，探討血管紋的改變對老年性聾發(fā)病相關(guān)機(jī)制的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組 SPF級健康C57BL/6J小鼠(江蘇常州卡文斯實驗動物有限公司)40只，分為兩組，青年組(3月齡)20只，體重10～15 g；老年組(24月齡)20只，體重25～40 g;均排除中耳及內(nèi)耳疾病。

1.2聽性腦干反應(yīng)(ABR)測試 兩組小鼠均在隔聲屏蔽室內(nèi)用10%水合氯醛(330 mg/kg)腹腔注射麻醉，采用美國Nicolet Compass系統(tǒng)的ABR檢測儀檢測各組小鼠ABR閾值;記錄電極刺入前顱頂正中皮下，參考電極刺入受試耳乳突皮下，接地電極刺入對側(cè)耳后皮下，TDH-39型耳機(jī)給聲，聲源距耳廓1 cm，用交替短聲(click)做刺激聲，重復(fù)率10次/秒。濾波范圍32～3 000 Hz，掃描時間10 ms，疊加512次;以引出可重復(fù)出現(xiàn)ABR波Ⅱ的最小刺激強(qiáng)度作為反應(yīng)閾值。

1.3耳蝸取材及切片 兩組小鼠完成ABR測試麻醉蘇醒后快速引頸脫臼斷頭處死，取顳骨，打開聽泡，暴露耳蝸，蝸尖鉆孔，置于4%多聚甲醛溶液(pH7.4)4 ℃冰箱內(nèi)固定20 h，PBS反復(fù)沖洗，10%EDTA(pH7.4)常溫脫鈣7天后，自來水沖洗數(shù)小時后，依次脫水、二甲苯、浸蠟、包埋，沿蝸軸縱向切片(厚度4 μm)，烤干后切片分別行HE染色和免疫組化染色。

1.4HE染色和免疫組化染色 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)HE染色：取出制備好的石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、不同梯度酒精水化和蒸餾水沖洗后，3%過氧化氫室溫孵育切片10 min，將其放入適量的枸櫞酸抗原修復(fù)液的燒杯，于水浴鍋中加熱至90 ℃(NF-κB，P21均加熱至96 ℃)15 min，室溫冷卻，置于PBS緩沖液中，用于下一步組化染色準(zhǔn)備。

免疫組化染色：參考PV9001說明書，將上述PBS緩沖液中的切片分別滴加濃度為1∶200兔抗鼠Claudin-5多克隆抗體(abcom)，37 ℃孵育60分鐘；濃度1∶100兔抗鼠NF-κB多克隆抗體(abcom)，4 ℃過夜；濃度1∶50兔抗鼠P21多克隆抗體(abcom)，4 ℃過夜。用PBS緩沖液洗3 min×3次，滴加適量的增強(qiáng)酶標(biāo)山羊抗兔G聚合物室溫20分鐘，室溫孵育 15 min。PBS緩沖液洗3 min×3次。DAB顯色，水洗，復(fù)染，脫水，透明，封片，顯微鏡下閱片。用PBS緩沖液代替一抗作為標(biāo)本染色的陰性對照，標(biāo)本中胞膜、胞漿及胞核中出現(xiàn)棕黃或者棕黑色顆粒為陽性染色。

1.5反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測 將分離耳蝸組織按常規(guī)頸椎脫臼法處死兩組小鼠各10只，剝離出雙側(cè)顳骨，置入二乙基焦碳酸酯水配制的PBS中，在顯微鏡下打開聽泡，去除骨性耳蝸，仔細(xì)剝離出血管紋組織，液氮中速凍-70 ℃保存。Trizol法抽提耳蝸組織標(biāo)本總RNA，取1 μg總RNA產(chǎn)物加oligo(dT)1 μl，再加DEPC水至總量達(dá)12 μl，65 ℃5 min，立即置于冰上驟冷。按下列體系合成cDNA：上述變性的RNA液12 μl，5×RT Buffer 4 μl，dNTP Mixture 2 μl，震蕩混勻后，經(jīng)過30 ℃10 min，42 ℃20 min，85 ℃5 min，40 ℃5 min后瞬時離心，獲得cDNA模板，合成產(chǎn)物-20度保存。

引物設(shè)計根據(jù)GenBank檢索小鼠Claudin-5、NF-κB、P21的核苷酸序列，利用Premier design軟件設(shè)計特異性上下游引物，Claudin-5引物：上游5'-TTCGCCAACATTGTCGTCC-3'，下游5'-TCTTCTTGTCGTAGTCGCCG-3'；NF-κB引物:上游5'-AGCACAGATACCACCAAGACC-3'，下游5'-GGGCACGATTGTCAAAGAT-3'；用GAPDH做內(nèi)參，其引物為：上游5'-CTTTGGTATCGTGGAAGG-3'，下游5'-GGATGATGTTCTGGAGAG-3'。具體步驟參照TAKARA PrimeScript One Step RT-PCR Kit試劑盒使用說明進(jìn)行操作，在PCR管中加入20 μl反應(yīng)體系，含滅菌超純水7 μl，PCR Mix10 μl，上下游引物各1 μl，模板cDNA1 μl。反應(yīng)程序：Claudin-5:98 ℃ 30 min→98 ℃ 30 s→63 ℃ 30 s→72 ℃2 min，循環(huán)30次，72度延長8 min，NF-κB：95 ℃ 30 min→94 ℃ 30 s→55 ℃ 30 s→72 ℃2 min，P21：95 ℃ 30 min→95 ℃ 30 s→60 ℃ 30 s→72 ℃2 min，72度延長7 min，各循環(huán)30次，采用GAPDH引物進(jìn)行PCR反應(yīng)作為參照，根據(jù)PCR實驗結(jié)果可知各指標(biāo)△CT值，采用2-△△CT方法計算各指標(biāo)表達(dá)水平比率即2-△△CT表達(dá)量的比值。以2-△△CT表示Claudin-5、NF-κB、P21相對量，計算老齡小鼠耳蝸各指標(biāo)相對量。

1.6Claudin-5、NF-κB、P21表達(dá) 用PBS緩沖液代替一抗作為標(biāo)本染色的陰性對照，標(biāo)本中胞膜、胞漿及胞核中出現(xiàn)棕黃或者棕黑色顆粒為陽性染色。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS14.0軟件，采用兩樣本t檢驗對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組小鼠ABR反應(yīng)閾比較 兩組小鼠ABR閾值見表1，可見，老年組小鼠ABR閾值明顯高于青年組小鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，符合老年性聾表現(xiàn)。

表1 兩組小鼠ABR閾值及RT-PCR檢測耳蝸內(nèi)Claudin-5、NF-κB、P21蛋白表達(dá)水平

2.2耳蝸血管紋形態(tài)學(xué)觀察 HE染色高倍鏡下觀察青年組、老年組C57BL/6J小鼠耳蝸血管紋形態(tài)結(jié)構(gòu)，可見青年組血管紋邊緣細(xì)胞排列整齊、有序、致密，中間細(xì)胞毛細(xì)血管網(wǎng)豐富，基底細(xì)胞呈串珠樣排列(圖1a)，老年組血管紋顯示萎縮，細(xì)胞疏散，分布不均(圖1b)。

圖1 兩組小鼠血管紋高倍鏡下觀(HE×400)(箭頭所示)

2.3免疫組化染色結(jié)果 Claudin-5在青年組C57BL/6J小鼠外側(cè)壁血管紋中大量表達(dá)，邊緣細(xì)胞、中間細(xì)胞和基底細(xì)胞均有染色，且染色較深;在老年組少量表達(dá)于邊緣細(xì)胞核中間細(xì)胞；NF-κB、P21在青年組小鼠血管紋中表達(dá)較少，在老年組中高表達(dá)于邊緣細(xì)胞和中間細(xì)胞(圖2)。

圖2 Claudin-5、NF-κB、P21在兩組小鼠耳蝸外側(cè)壁血管紋表達(dá)(免疫組化×600) 黑色箭頭示邊緣細(xì)胞，藍(lán)色箭頭示中間細(xì)胞，紅色箭頭示基底細(xì)胞); a.b分別顯示Claudin-5在青年組和老年組C57BL/6J小鼠外側(cè)壁血管紋表達(dá)，在青年組小鼠邊緣細(xì)胞、中間細(xì)胞和基底細(xì)胞及散在的螺旋韌帶結(jié)蹄組織細(xì)胞均有染色，且染色較深，在老年組少量表達(dá)于邊緣細(xì)胞和中間細(xì)胞；c.d分別顯示NF-κB在青年組和老年組C57BL/6J小鼠外側(cè)壁血管紋表達(dá)；e.f分別顯示P21在青年組和老年組C57BL/6J小鼠外側(cè)壁血管紋表達(dá)，在老年組中高表達(dá)于邊緣細(xì)胞和中間細(xì)胞

2.4RT-PCR結(jié)果 兩組小鼠耳蝸內(nèi)Claudin-5、NF-κB、P21的表達(dá)水平見表1，可見，與青年組相比，Claudin-5在老年組耳蝸內(nèi)表達(dá)降低(P<0.05)；NF-κB和P21在老年組耳蝸中表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)。

3 討論

隨著全球人口老齡化的進(jìn)程，老年性聾發(fā)病率逐漸增高，其發(fā)生年齡、發(fā)展速度、聽力損失程度及對生活的影響等因人而異，近年來對耳聾研究也越來越深入，包括突觸退化、內(nèi)耳免疫、基因治療和載體研發(fā)等研究取得了一定的進(jìn)展[4]。老年性聾病因復(fù)雜，與很多系統(tǒng)性疾病相關(guān)，如糖尿病、高血壓、高脂血癥等影響微循環(huán)的心腦血管疾病，臨床發(fā)現(xiàn)老年性聾患者中“三高”人群比例較高。本實驗以微循環(huán)障礙對內(nèi)耳造成血供不足為出發(fā)點，研究老齡化小鼠耳蝸外側(cè)壁血管紋組織結(jié)構(gòu)和分子間連接是否異常，探討血管紋的異常改變是否影響內(nèi)耳血供導(dǎo)致聽力減退，以探索耳聾發(fā)生過程的分子信號途徑。

C57BL/6J小鼠是模擬人類年齡相關(guān)性聽力下降比較成熟的動物模型，其16周齡開始出現(xiàn)聽力減退，26周齡聽力明顯下降[4]。本研究結(jié)果顯示老年組小鼠ABR反應(yīng)閾高于青年組，符合老年性聾的表現(xiàn);本研究通過觀察青年組和老齡組小鼠模型耳蝸血管紋Claudin-5、NF-κB、P21的表達(dá)差異，探討Claudin-5、NF-κB、P21對老年小鼠血管紋的影響及其在老年性聾發(fā)病機(jī)制中的作用。Claudin-5是內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的重要成分，在不同的組織表達(dá)不同，與血腦屏障通透性的改變密切相關(guān)，是近年的研究熱點。已有研究表明[5]Claudin-5表達(dá)異常時可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞間結(jié)構(gòu)受損。Shoichro等[6]認(rèn)為Claudin-5是調(diào)節(jié)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性最重要的調(diào)節(jié)因子；Ishizaki等[7]的研究證明，cAMP可以通過依賴或非依賴蛋白激酶A途徑，通過蘇氨酸磷酸化上調(diào)豬血腦屏障上Claudin-5的表達(dá)，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞上緊密連接的功能;后者可激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，此信號分子是多種“損傷反應(yīng)基因”的多效轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[8]，NF-κB活化還可以通過調(diào)控細(xì)胞周期蛋白(如P21)的表達(dá)而抑制細(xì)胞生長，P21蛋白參與細(xì)胞的生長、分化、衰老及死亡過程[9]。近年來有實驗表明緊密連接蛋白在豚鼠耳蝸外側(cè)壁血管紋緊密連接中的高濃度表達(dá)與維持血迷路屏障結(jié)構(gòu)、功能密切相關(guān)[10]。老年組小鼠血管紋萎縮，細(xì)胞間連接縫隙增大，血管內(nèi)皮細(xì)胞萎縮或閉塞，提示C57BL/6J小鼠隨著老化的進(jìn)程，血管紋萎縮可能導(dǎo)致離子通道異常開放，內(nèi)淋巴循環(huán)障礙，最終導(dǎo)致聽力下降。本研究結(jié)果顯示Claudin-5蛋白在老年組小鼠萎縮的血管紋中低表達(dá)，在耳蝸內(nèi)的含量亦減少，表明Claudin-5表達(dá)異常導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損萎縮；進(jìn)一步觀察NF-κB、P21在耳蝸外側(cè)壁血管中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，NF-κB、P21在老年組小鼠血管紋中高表達(dá)，提示NF-κB、P21在衰老的進(jìn)程中表達(dá)增多。推測氧化應(yīng)激、血管變性萎縮等體內(nèi)衰變多種因素刺激cAMP通過依賴或非依賴蛋白激酶A途徑，下調(diào)Claudin-5的表達(dá)，激活下游因子NF-κB產(chǎn)生促炎反應(yīng)，導(dǎo)致血管紋內(nèi)皮細(xì)胞通透性增大，離子通道異常開放，內(nèi)淋巴失衡，并激活P21，抑制細(xì)胞周期的進(jìn)程，最終引起內(nèi)耳缺血，聽覺細(xì)胞凋亡或壞死，導(dǎo)致聽力下降。

綜上所述，Claudin-5、NF-κB、P21在老年組C57BL/6J小鼠耳蝸外側(cè)壁血管紋內(nèi)均有表達(dá)，Claudin-5表達(dá)低可能與血管紋通透性相關(guān)，NF-κB 和P21表達(dá)增多可能與內(nèi)外淋巴循環(huán)紊亂和細(xì)胞凋亡有關(guān)，其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。