大鼠自身免疫性聽神經(jīng)病模型的建立*

周媛 王斌 羅軍

聽神經(jīng)病缺乏有效的治療，其發(fā)病機(jī)制及病理仍需進(jìn)一步研究。有研究表明，內(nèi)耳自身免疫可能是引起聽神經(jīng)病的重要原因[1～3]。P0蛋白是周圍神經(jīng)髓鞘細(xì)胞膜上的一種結(jié)構(gòu)蛋白，其含量約占細(xì)胞膜蛋白含量的50%以上；該蛋白在內(nèi)耳中分布于耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)、聽神經(jīng)的有髓神經(jīng)纖維髓鞘中[4]。Cao等[5]發(fā)現(xiàn)P0蛋白為自身免疫性內(nèi)耳病的相關(guān)抗原，并且具有內(nèi)耳組織特異性；林熹等[6]用純化的P0蛋白成功誘發(fā)了豚鼠內(nèi)耳自身免疫反應(yīng)。本研究擬用P0蛋白免疫大鼠，增加P0蛋白免疫量，并延長免疫周期，旨在建立免疫成功率更高的自身免疫性聽神經(jīng)病動物模型，為聽神經(jīng)病的研究提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1P0蛋白的提取和純化 健康SD大鼠20只，雌雄不限，體重250～300克，由鄭州大學(xué)實驗動物中心提供。用10%水合氯醛(4 ml/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉，動物麻醉后斷頭，迅速取出聽泡，在無菌及4 ℃條件下取出全膜迷路組織，參照林熹[6]的方法，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)提取和純化P0蛋白：將全膜迷路組織置于含1%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、10 mmol/L二巰基乙醇(β-ME)和40 mg/ml苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)(均購于sigma，美國)的PBS中，反復(fù)凍融4次，4 ℃下以12 000轉(zhuǎn)離心30分鐘，取上清蛋白液，即為粗提膜迷路蛋白液；采用BCA(bicinchoninic acid，二喹啉甲酸)法測定蛋白濃度，BCA試劑盒購自賽默飛公司。分別灌制濃度為5%的濃縮膠和濃度為12.5%的分離膠，將粗提膜迷路蛋白液與等體積的樣品緩沖液(4%SDS、2%二巰基乙醇和l%溴酚藍(lán))沸水浴3分鐘，加樣4 ℃下恒溫電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)泳至膠的底部時結(jié)束電泳。將凝膠浸泡于冰冷的0.5 mol/L KCl溶液約10分鐘，切下相當(dāng)于30 kD的條帶，電洗脫約4小時，回收蛋白液，用聚乙二醇適當(dāng)濃縮。BCA法測定蛋白濃度，將蛋白液依次用0.1 mol/L MgCl2、溶血磷脂酰膽堿(lysophosphatidylcholine，LPC)透析去除結(jié)合在P0蛋白上的SDS，濃縮后低溫貯存，備用。

1.2動物分組及P0蛋白免疫大鼠建立動物模型 健康SD大鼠60只，雌雄不限，體重250～300克。隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成對照組10只、實驗組50只。實驗組用上述純化的大鼠P0蛋白作為抗原進(jìn)行免疫，為了提高免疫成功率，本研究增加了P0蛋白免疫量，用含400 μg/ml P0蛋白的凝膠勻漿液1 ml與等量完全弗氏佐劑(Gibco，美國)乳化后，給予大鼠雙后肢內(nèi)側(cè)及背部多點皮下注射，并延長免疫周期，共免疫8周，每間隔一周，用首次抗原用量的一半與等量不完全弗氏佐劑作加強(qiáng)注射。對照組在同一時間和部位以不含抗原的等量弗氏佐劑注射。

1.3聽功能測試 分別于免疫后2、4、6、8周檢測各組大鼠聽性腦干反應(yīng)(ABR)、畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(DPOAE)的變化。

ABR檢測：采用美國TDT系統(tǒng)(Tucker-Davis Technologies hardware and software, TDT System III, Alachua, FL, USA)，動物麻醉后，隔聲屏蔽室內(nèi)，將參考電極置于測試耳耳后，記錄電極置于顱頂正中，接地電極置于測試耳對側(cè)耳后。刺激聲為短聲(click)，帶通濾波寬度設(shè)置為300～3 000 Hz，疊加次數(shù)為1 024次，最大刺激強(qiáng)度為100 dB SPL，每隔10 dB遞減，以能分辨出可重復(fù)的ABR波V的最低刺激強(qiáng)度判斷閾值；先測試左耳，再測試右耳。ABR測試結(jié)束后，立即行DPOAE檢測，采用Madsen Capella Plus耳聲發(fā)射儀進(jìn)行DPOAE測試，探頭密封于外耳道內(nèi)，原始純音頻率比f2/f1為1.2，L2/L1=60/65 dB SPL；f2分別為0.5、1、2、4、8 kHz，疊加120次，以DPOAE幅值大于本底噪聲3 dB為引出標(biāo)準(zhǔn)；先測試左耳，再測試右耳。

1.4血清IgG水平測定 免疫前，采用酶聯(lián)免疫吸附測定(試劑盒購于R&D Systems，美國)檢測血清抗P0蛋白抗體的IgG水平；于最后1次ABR測試結(jié)束后(即免疫8周后)心臟取血，收集血清，同法再次檢測血清抗P0蛋白抗體的IgG水平；以測得的吸光度表示IgG水平。

1.5內(nèi)耳形態(tài)學(xué)觀察 動物于最后一次聽功能測試結(jié)束后處死，迅速取出聽泡，4%多聚甲醛固定，10%EDTA脫鈣，常規(guī)石蠟包埋,連續(xù)中軸切片，光鏡(Leica，DMIL-PL，德國)觀察內(nèi)耳組織學(xué)變化并行螺旋神經(jīng)元計數(shù)[7]。電鏡(日立S4800，日本)觀察：聽泡蝸尖鉆孔灌注3%戊二醛，1%四氧化鋨后固定，梯度乙醇脫水，醋酸異戊酯過度，臨界點干燥、鍍膜，掃描電鏡觀察毛細(xì)胞。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS10.0軟件進(jìn)行t檢驗和方差分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±standard deviation)表示。

2 結(jié)果

提取的P0蛋白經(jīng)SDS-PAGE后顯示，只在相對分子質(zhì)量為30 kD的位置上出現(xiàn)單一的蛋白染色帶，證明本實驗純化的確為P0蛋白(P0蛋白分子量約為30 kD)。提取純化P0蛋白的效率為：4.12 mg純化P0蛋白/45.51 mg粗提膜迷路蛋白。

實驗組50只大鼠，在實驗中死亡5只；對照組10只，2只死亡。存活大鼠行耳鏡檢查，無中耳炎。

2.1免疫8周后大鼠血清IgG水平 實驗組免疫前血清中抗P0蛋白的IgG水平與對照組無明顯差異，免疫8周后，實驗組大鼠血清IgG水平升高，明顯高于免疫前和對照組(P<0.05)(表1)。

表1 兩組大鼠免疫前后血清IgG水平

2.2DPOAE檢測結(jié)果 免疫前后實驗組及對照組均可正常引出DPOAE(圖1)，免疫8周后，實驗組DPOAE振幅無明顯變化(P>0.05)(表2)。

圖1 實驗組大鼠P0蛋白免疫前(a)、后(b)DPOAE圖

表2 實驗組各頻率免疫前后DPOAE幅值

2.3ABR檢測結(jié)果 實驗組存活的45只大鼠，于免疫8周后，16只(32耳)波V反應(yīng)閾提高≥40 dB(36%，16/45)，18只(36耳)波V反應(yīng)閾提高<20 dB(40%,18/45),11只(22耳)ABR波V反應(yīng)閾提高<10 dB(24%,11/45)。ABR波V反應(yīng)閾提高≥40 dB的16只(32耳)大鼠及對照組各時間點的ABR波V反應(yīng)閾見表3，可見與對照組相比較，隨著免疫時間的延長，實驗組大鼠ABR反應(yīng)閾逐漸升高，免疫8周后，閾值升高最為明顯(P<0.01)。

表3 兩組大鼠免疫前及免疫后各時間點ABR反應(yīng)閾

2.4耳蝸的形態(tài)學(xué)變化 免疫8周后兩組大鼠螺旋神經(jīng)元計數(shù)結(jié)果見表4，可見實驗組羅氏管內(nèi)螺旋神經(jīng)元缺失嚴(yán)重(圖2),螺旋神經(jīng)元數(shù)量明顯減少(P<0.05)。

圖2 實驗組P0免疫前后螺旋神經(jīng)元缺失情況 a.免疫前正常羅氏管，示螺旋神經(jīng)元；b.P0免疫后8周，僅見少量殘余螺旋神經(jīng)元細(xì)胞，神經(jīng)節(jié)區(qū)域呈現(xiàn)“荒漠樣”改變(bar=100 μm)

表4 兩組大鼠免疫8周后耳蝸各回螺旋神經(jīng)元計數(shù)

2.5實驗組免疫前后毛細(xì)胞的電鏡觀察 免疫8周后與免疫前比較，實驗組毛細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，無明顯缺失(圖3)。

3 討論

聽神經(jīng)病(auditory neuropathy，AN)的病因及發(fā)病機(jī)制一直是研究的難點, 學(xué)者們的研究表明內(nèi)耳自身免疫與AN發(fā)病有關(guān)[8～11]。國內(nèi)外學(xué)者先后建立了不同的自身免疫性AN動物模型，Matsuoka[8]用P0蛋白誘導(dǎo)鼠產(chǎn)生自身免疫性神經(jīng)炎，為周圍神經(jīng)脫髓鞘病變，動物出現(xiàn)聽神經(jīng)病的聽力學(xué)改變，但對蝸神經(jīng)脫髓鞘改變未能予以電鏡證實；宋鵬等[9]以粗提的牛外周神經(jīng)髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)作為抗原免疫豚鼠后，其ABR反應(yīng)閾升高，伴波I、Ⅲ、V潛伏期明顯延長，坐骨神經(jīng)、聽神經(jīng)均發(fā)生脫髓鞘改變；劉宏建等[10]提取、純化耳蝸神經(jīng)抗原免疫豚鼠，免疫后豚鼠聽性腦干反應(yīng)閾提高10～25 dB；林熹等[6]用純化的P0蛋白免疫豚鼠，建立了豚鼠自身免疫性AN動物模型，免疫后有22%的豚鼠ABR反應(yīng)閾升高。李海英等[11]用從豚鼠內(nèi)耳組織中純化的P0蛋白免疫SD大鼠，以ABR閾值較免疫前升高15 dB為陽性，電鏡下可見聽神經(jīng)的脫髓鞘病變。本研究在上述研究者的方法上加以改進(jìn)，加大了P0蛋白的免疫量，并將免疫周期延長至8周，結(jié)果45只(90耳)大鼠中有16只(32耳)(36%，16/45)ABR的波V反應(yīng)閾升高≥40 dB，ABR嚴(yán)重異常，DPOAE正常，免疫成功率(36%)較高。

Matsuoka等[8]用從牛周圍神經(jīng)純化的P0蛋白免疫小鼠，成功地使其中約20%的小鼠聽力減退，組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)蝸軸區(qū)域炎性細(xì)胞浸潤，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目減少，提示P0蛋白在自身免疫性感音神經(jīng)性聾中起到作用。本研究中用P0蛋白免疫大鼠后，光鏡下見實驗組大鼠羅氏管中螺旋神經(jīng)元明顯缺失，螺旋神經(jīng)元計數(shù)亦證實螺旋神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，與Matsuoka等[8]的報道相同；本研究中大鼠毛細(xì)胞的形態(tài)與數(shù)量無明顯變化，ABR閾值升高，而DPOAE未見異常，說明P0蛋白免疫大鼠后導(dǎo)致了蝸后性聾。

Passali等[12]發(fā)現(xiàn)部分耳聾患者的血液中存在抗P0蛋白IgG抗體，本研究在免疫前后檢測了大鼠血清中IgG水平，免疫8周后大鼠血清IgG水平較免疫前明顯升高，說明機(jī)體對P0蛋白產(chǎn)生了免疫反應(yīng)；隨著免疫時間的延長，其ABR閾值逐漸提高，螺旋神經(jīng)元的數(shù)量明顯減少，但DPOAE正常，毛細(xì)胞無明顯變化。這些結(jié)果均提示P0蛋白誘發(fā)了內(nèi)耳自身免疫反應(yīng)，且免疫反應(yīng)的程度隨著免疫時間的延長而逐漸加重；由此可見，P0蛋白免疫量的增加及免疫時間的延長對造模成功起到了重要作用。

本研究成功建立了自身免疫性聽神經(jīng)病動物模型，對自身免疫性聽神經(jīng)病的后續(xù)研究，如：機(jī)制探索、藥物治療等提供了實驗基礎(chǔ)。