近紅外光譜技術(shù)對香附及其炮制品醇溶性浸出物的快速測定

喬 璐，呂 芳，王若晨，董誠明*，張園園，牛曉雅，張 娟

（1. 河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院， 河南 鄭州 450046； 2. 河南中醫(yī)藥大學(xué) 針灸推拿學(xué)院， 河南 鄭州 450046）

香附為莎草科植物莎草Cyperus rotundus L.的干燥根莖[1]，具有疏肝解郁、調(diào)經(jīng)止痛之功效，用于治療肝郁氣滯、胸肋脹痛、疝氣疼痛等癥。中藥炮制的目的在于改變藥物的性能和功效，因炮制方法不同其功效有所差別，香附的炮制品主要有醋香附、酒香附、炙香附和四制香附等， 2020 版《中國藥典》中對香附及其炮制品的檢驗標(biāo)準(zhǔn)較少，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，鑒別存在困難。近紅外光譜技術(shù)作為一種快速無損的分析方法[2-5]，為中藥材質(zhì)量評價和鑒別提供了新的途徑。本實驗將近紅外技術(shù)與化學(xué)計量相結(jié)合，建立了香附及其炮制品的醇溶性浸出物含量快速檢測及各炮制品的特征波段篩選，為香附及其炮制品的質(zhì)量評價提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 藥材與試劑

60 批香附藥材采購于河南、山東、浙江、廣東、山西、河北、安徽、亳州和海南等9 地區(qū)，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院董誠明教授鑒定，每批藥材分為4份用于炮制。藥材及其炮制品粉碎后過5 號標(biāo)準(zhǔn)篩。醫(yī)用乙醇（95%，新鄉(xiāng)市三偉消毒制劑有限公司）。

1.2 儀器

FA2004N 型電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；Antaris II 型傅立葉變換近紅外光譜儀（ThermoFisher Scientific 公司）；SUS304 型高速粉碎機(jī)；TQ Analyst9.0 軟件處理光譜。

2 方法與結(jié)果

2.1 炮制樣品的制備

醋香附：稱取約100 g 生香附，加20 g 米醋拌勻，潤透，用文火炒干；酒香附：稱取約100 g 生香附，加20 g 黃酒拌勻，潤透，用文火炒干；四制香附：稱取約100 g 生香附，加5 g 生姜汁、10 g 米醋、10 g 黃酒、食鹽水（食鹽2 g，清水溶化）拌勻，潤透，用文火炒干[6]。

2.2 醇溶性浸出物測定方法

精密稱定供試品約3.8 g，置250 mL 錐形瓶中，精密加稀乙醇（50%左右，由95%乙醇配制）約100 mL，密塞，稱定重量，靜置1 h，時時振搖，連接冷凝回流管，加熱至微沸，并保持微沸1 h。放冷后，取下錐形瓶，密塞，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足失重，搖勻，用干燥濾器濾過，精密量取濾液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，于105℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量[1]。測得香附及炮制品的醇溶性浸出物的測量含量分別為生香附：15.64% ～ 26.16%，醋香附：15.02% ～26.15%， 酒 香 附15.32% ～ 25.80%， 四 制 香 附：15.35% ～ 27.46%，醇浸出物均達(dá)到2020 版《中國藥典》規(guī)定。由實驗結(jié)果得到四制香附的浸出物含量最高，較生香附提高4.5%，醋香附、酒香附含量變化較小。

2.3 光譜采集

對香附其及炮制品共計240 個樣品進(jìn)行光譜采集，樣品采樣的方式為旋轉(zhuǎn)采樣，光譜范圍為12 000 ～4 000 cm-1。背景光譜掃描32次，每個樣品掃描64次，掃描時間平均為60 s，實驗所得樣品光譜為直接去除背景的光譜，見圖1。

圖1 香附原始近紅外光譜Fig. 1 Original near infrared spectrum of Cyperus rotundus L.

2.4 建立模型

2.4.1 光譜預(yù)處理 需對香附藥材的近紅外原始光譜預(yù)處理，提高模型的性能。常用的預(yù)處理方法有一階導(dǎo)數(shù)（First Derivative, FD）、二階導(dǎo)數(shù)（Second Derivative, SD）、多元散射校正（Multiplicative signal correction，MSC）、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換（Standard normal varidte transformation，SNV）、矢量歸一化、最大－最小歸一化等[7-8]。

本實驗采用偏最小二乘法（Partial least squares，PLS）為建模方法，以校正集均方差（Root Mean Square Error of Calibration , RMSEC）、驗證集均方差（Root Mean Square Error of Prediction, RMSEP）、校正集相關(guān)系數(shù)、驗證集相關(guān)系數(shù)及相關(guān)系數(shù)（R2）作為最佳光譜預(yù)處理的評價指標(biāo)。

在滿足RMSEP/RMSEC ≤1.2 的條件下，所建光譜RMSEC 越小，表明校正模型建立越合理；RMSEP 越小，表預(yù)明模型的測性能越好；R2越接近于1，表明模型的預(yù)測準(zhǔn)確性越高[7-8]。生、醋、酒、四制香附醇溶性浸出物含量的近紅外光譜預(yù)處理方法效果最好的依次為SNV ＋FD、MSC ＋原始光譜、原始光譜和原始光譜。其分析方法見表1。

表1 光譜預(yù)處理Tab. 1 Spectral pretreatment

2.4.2 波段選擇 不同波段建立的模型預(yù)測性不同，建模波段的范圍過長，將包括大量的多余信息，降低了模型的預(yù)測準(zhǔn)確性；波段范圍過短，缺乏代表性，也影響模型的適用性和預(yù) 測 性[4]。 本 實 驗 根 據(jù)R2、RMSEC、RMSEP及RMSEP/RMSEC 為綜合指標(biāo)選取最佳波段結(jié)果見表2。生、醋、酒、四制香附浸出物含量的最 佳 建 模 波 段 依 次 為4 046.76 ～ 5 079.58 cm-1、

4 042.63 ～ 4 959.74 cm-1、4 238.77 ～ 4 867.73 cm-1、4 000.00 ～ 5 400.00 cm-1。

2.4.3 主因子數(shù)的選擇 PLS 建立定量模型時，主因子數(shù)的不同，導(dǎo)致模型預(yù)測結(jié)果差異也不同。主因子數(shù)過多，導(dǎo)致“過度擬合”現(xiàn)象，主因子數(shù)過少，模型預(yù)測能力較差[7]。以內(nèi)部交叉驗證均方差（Cross-validation Mean Square Error, RMSECV） 為指標(biāo)，考察主因子數(shù)對浸出物含量的影響。當(dāng)生、醋、酒、四制香附樣品的主因子數(shù)分別為7、10、10、10時，模型的RMSECV 值最低，模型預(yù)測精確度較高。

表2 香附及其炮制品浸出物不同光譜范圍的影響Tab. 2 Effects of different spectral ranges of the extracts from Cyperus rotundus L. and its processed products

2.4.4 校正集與驗證集樣品的選擇 隨機(jī)選取52 個生香附、51 個醋香附、49 個酒香附、50 個四制香附樣品校正集見表3，含量范圍分別為15.64% ～26.16%、15.02% ～ 26.15%、15.32% ～ 25.80%、15.35% ～ 27.46%，剩余樣品作為驗證集。驗證集的范圍均在校正集范圍之內(nèi)，具有可驗證性。

表3 校正集與驗證集Tab. 3 Calibration and validation

2.4.5 定量模型的建立 通過PLS 法建模對香附浸出物含量建立定量模型。藥材樣品中生、醋、酒、四制香附所建模型分別為R2＝0.980 2，RMSEC ＝0.005 38； R2＝0.969 8，RMSEC＝0.006 54；R2＝0.958 9，RMSEC ＝0.007 34；R2＝0.964 2，RMSEC ＝0.008 70；驗證集相關(guān)系數(shù)為R2＝0.966 8、 R2＝0.977 9、 R2＝0.983 2、R2＝ 0.965 0，RMSEP ＝0.005 21、RMSEP ＝0.004 77、RMSEP ＝0.004 58、RMSEP ＝ 0.007 53。實測值與參考值的相關(guān)圖見圖 2，偏差圖見圖 3。由圖可知，檢驗樣本集中在趨勢線y ＝x 附近，該模型精度高，均方根誤差小。

2.4.6 模型的驗證 根據(jù)香附藥材樣品及相關(guān)評價性參數(shù)建立的模型，對驗證集進(jìn)行驗證，結(jié)果見表4。從表可知，在建立醇溶液浸出物的近紅外模型中，生、醋、酒、四制香附樣品外部驗證集的實測值與參考值絕對誤差最大值分別為0.95%、1.01%、0.98%、1.11%，相對誤差最大值分別為4.76%、4.64%、4.77%、5.94%，平均相對誤差分別為2.27%、2.14%、1.94%、3.07%。所建模型的預(yù)測性準(zhǔn)確。

圖2 實測值與預(yù)測值Fig. 2 Measured values and calculated values

圖3 實測值與預(yù)測值的偏差圖Fig. 3 Deviation between the measured value and the reference value

表4 驗證集醇溶液浸出物參數(shù)比較Tab. 4 Verifies the comparison of the parameters of the extract with alcohol

3 討論

本實驗根據(jù)2020 版《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)利用傳統(tǒng)熱浸法與近紅外光譜法相結(jié)合的方式，采用TQ 9.0 建立了近紅外快速測定中藥材香附及其炮制品（醋、酒、四制香附）中的醇溶液浸出物含量模型，其中生香附：15.64% ～ 26.16%，醋香附：15.02% ～26.15%，酒香附：15.32% ～ 25.80%，四制香附：15.35% ～ 27.46%，醇浸出物均達(dá)到2020 版《中國藥典》規(guī)定。以生香附為對照，對比醋、酒、四制浸出物的含量，發(fā)現(xiàn)四制較生香附提高4.5%，根據(jù)綜合指標(biāo)參數(shù)選擇生、醋、酒、四制香附最佳預(yù)測波段依次為4 046.76 ～ 5 079.58 cm-1、4 042.63 ～ 4 959.74 cm-1、4 238.77 ～ 4 867.73 cm-1、4 000.00 ～5 400.00 cm-1。其中在4 800.00 ～ 5 300.00 cm-1的吸收峰存在較大差異，這也是香附炮制品的特征波段。利用PLS 方法建立香附藥材醇浸出物的近紅外定量校正模型。其中R2分別為0.958 9、0.942 8、0.929 2、0.929 6，RMSEC 為0.005 38、0.006 54、0.007 34、0.008 70；RMSEP 為0.005 21、0.004 77、0.004 58、0.007 53。生、醋、酒、四制香附樣品外部驗證集的實測值與參考值絕對誤差最大值分別為0.95%、1.01%、0.98%、1.11%，相對誤差最大值分別為4.76%、4.64%、4.77%、5.94%，平均相對誤差分別為2.27%、2.14%、1.94%、3.07%，說明所建近紅外定量分析模型較準(zhǔn)確。

4 結(jié)論

本實驗將近紅外技術(shù)與化學(xué)計量相結(jié)合，建立了香附及其炮制品醋香附、四制香附、酒香附的醇溶性浸出物含量快速檢測及各炮制品的特征波段提取篩選方法，為建立香附不同炮制品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供數(shù)據(jù)支撐。