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    馬錢苷元抗大鼠實驗性心律失常的作用與機制預(yù)測

    2021-05-21 03:33:22姚景春張貴民
    現(xiàn)代中藥研究與實踐 2021年2期
    關(guān)鍵詞:室顫結(jié)合能烏頭

    馮 群,李 欣,姚景春,肖 敏,趙 濤,張貴民*

    (1.魯南制藥集團股份有限公司 新藥安評中心,中藥制藥共性技術(shù)國家重點實驗室,山東 臨沂 276006;2.山東新時代藥業(yè)有限公司,山東 臨沂 273400)

    心律失常(arrhythmia)是心血管疾病中重要的一組疾病,可單獨發(fā)病或與其它心血管病伴隨發(fā)生,具有較高的發(fā)病率和潛在的死亡危險[1]。心律失常通常是由于竇房結(jié)激動異?;蚣赢a(chǎn)生于竇房結(jié)以外,激動的傳導緩慢、阻滯或經(jīng)異常通道傳導,即心臟活動的起源和(或)傳導障礙導致心臟搏動的頻率和(或)節(jié)律異常[2]。其預(yù)后與心律失常的病因、誘因、演變趨勢、是否導致嚴重血流動力障礙有關(guān),可突然發(fā)作而致猝死,亦可持續(xù)累及心臟而致其衰竭。心律失常大多通過心電圖確診[3]。目前臨床應(yīng)用的抗心律失常藥物已近50 余種,至今還沒有統(tǒng)一的分類標準。大多數(shù)學者同意根據(jù)藥物對心臟的不同作用原理將抗心律失常藥物分為四類:鈉通道阻滯藥、β 腎上腺素受體阻斷藥、延長動作電位時程藥、鈣通道阻滯劑,以指導臨床合理用藥。長期服用抗心律失常藥均有不同程度的副作用,嚴重的可引起室性心律失常或心臟傳導阻滯而致命。目前抗心律失常的西醫(yī)藥物治療研究已經(jīng)進入瓶頸期,而某些國產(chǎn)中成藥在治療此疾病方面具有獨特優(yōu)勢[4]。

    作為山茱萸果實中的成分之一,馬錢苷元也可以通過馬錢苷的降解而得。山茱萸及其有效成分可通過脂質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激、炎性因子和免疫調(diào)節(jié)等路徑發(fā)揮神經(jīng)保護、強心、肝臟和腎臟保護等藥理作用[5-7]?,F(xiàn)代藥理學研究已經(jīng)證明了山茱萸提取物及馬錢苷抗心律失常作用的有效性[8],但馬錢苷元的抗心律失常作用仍不明確。本實驗建立2 種不同的心律失常大鼠模型,考察馬錢苷元對心律失常大鼠的保護作用,利用分子對接技術(shù)探索馬錢苷元與抗心律失常靶點的相互作用,為其開發(fā)提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 藥物與試劑 馬錢苷元(C11H16O5,CAS:29748-10-5),由山東新時代藥業(yè)有限公司提供(97.51%);氯仿(分析純,西隴科學股份有限公司);烏頭堿(分析純,南京澤朗植提技術(shù)有限公司);鹽酸胺碘酮注射液[賽諾菲安萬特(杭州)制藥有限公司]。

    1.1.2 實驗動物 SPF 級SD 大鼠,體質(zhì)量為180 ~220 g。購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司,動物使用許可證號:SYXK(魯)20180008,大鼠入室后至少檢疫3 d,區(qū)分性別飼養(yǎng)。研究中所有實驗動物相關(guān)的操作嚴格按照國際實驗室動物倫理行為準則“Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”實施[9]。

    1.1.3 主要儀器 Waters 2489 型高效液相色譜儀(美國Waters 公司);SP2006 型心電圖分析系統(tǒng)(北京軟隆科技有限責任公司);PL-2002 型電子天平(梅特勒-托利多)。

    1.2 方法

    1.2.1 氯仿誘發(fā)大鼠心律失常實驗 取SD 大鼠40只,按照性別和體質(zhì)量隨機分為4 組,模型組、馬錢苷元低、高劑量組、胺碘酮組,每組10 只,雌雄各半。模型組按照10 mL/kg 腹腔注射生理鹽水,馬錢苷元劑量組按照10 mL/kg 腹腔注射馬錢苷元1 mg/kg、10 mg/kg,胺碘酮組按照5 mL/kg 靜脈注射鹽酸胺碘酮注射液20 mg/kg,連續(xù)給藥3 d,1 次/d。末次給藥30 min 后,將大鼠放入含有10 mL 氯仿棉球的倒置2 000 mL 燒杯中(每換1 只大鼠添加2 mL 氯仿),待呼吸停止后立即沿胸骨左緣剖開胸腔,觀察心臟跳動節(jié)律,以確定是否發(fā)生室顫,記錄室顫大鼠數(shù),計算室顫發(fā)生率[10]。

    1.2.2 烏頭堿誘發(fā)大鼠心律失常實驗 取SD 大鼠40 只,按照性別和體質(zhì)量隨機分為4 組,模型組、馬錢苷元低、高劑量組、胺碘酮組,每組10 只,雌雄各半。模型組按照10 mL/kg 腹腔注射生理鹽水,馬錢苷元低、高劑量組按照10 mL/kg 分別腹腔注射馬錢苷元1 mg/kg、10 mg/kg,胺碘酮組按照5 mL/kg靜脈注射鹽酸胺碘酮注射液20 mg/kg,各組大鼠連續(xù)給藥3 d,1 次/d。末次給藥30 min 后,以3%戊巴比妥鈉按45 mg/kg 將大鼠麻醉后,仰臥固定于大鼠手術(shù)臺上,以針形電極扎入四肢皮下,用SP 2006心電圖分析系統(tǒng)檢測Ⅱ?qū)?lián)心電圖,心電圖穩(wěn)定后尾靜脈快速注射烏頭堿(20 g/kg),觀察心電圖變化,記錄大鼠室早的出現(xiàn)及終止時間,計算大鼠室早潛伏期和持續(xù)時間[11]。

    1.2.3 分子對接 從KEGG 數(shù)據(jù)庫(https://www.kegg.jp/kegg/drug/)[12]中檢索抗心律失常藥物及其對應(yīng)的靶點,共得到66 個藥物和39 個靶點,根據(jù)藥物分類和作用通路,分別選擇SCN5A、ADRB1、KCNH2 和CACNA1C 作為受體,馬錢苷元作為配體,并同已上市藥物利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)、胺碘酮(amiodarone)、維拉帕米(verapamil)比較與受體的結(jié)合能和結(jié)合位點。

    下載上述配體/ 藥物的mol2 格式文件,用Autodock Tool 軟件打開該化合物,使其能量最小化并判定化合物的Root、選定可扭轉(zhuǎn)的鍵,保存為*pdbqt格式文件。從PDB 數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)[13]下載受體的PDB 格式文件,運用Pymol 軟件移除靶蛋白中的配體和非蛋白分子(如水分子),再保存為PDB 格式文件。隨后用Autodock Tool 軟件打開的PDB 文件,加氫、計算電荷并“Assign AD4 type”給蛋白添加原子類型,將其保存為*pdbqt 格式文件[14]。運用Autodock vina 將配體/藥物和受體進行對接。結(jié)合能小于0 說明配體與受體可以自發(fā)結(jié)合,目前對于活性分子的靶點篩選尚無統(tǒng)一標準,本實驗對結(jié)合能進行排序,結(jié)合能排序靠前且數(shù)值絕對值越大,對接結(jié)果較好。

    1.2.4 統(tǒng)計學方法 用SPSS 21.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析,計量資料用均數(shù)±標準差(±s)表示,多組間比較采用方差分析,兩兩比較采用t 檢驗。計數(shù)資料用例與百分數(shù) [n(%)] 表示,采用χ2檢驗。以P <0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 馬錢苷元對氯仿所致心律失常的影響

    與模型組比較,馬錢苷元高劑量組和胺碘酮組大鼠室顫率明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義 (P <0.01),馬錢苷元低劑量組大鼠室顫率無明顯降低,見表1。表明馬錢苷元高劑量組可以抗室顫。

    表1 各組大鼠室顫情況[n(%)]Tab. 1 Incidence comparation of ventricular fibrillation in each group[n(%)]

    2.2 馬錢苷元對烏頭堿所致心律失常的影響

    實驗結(jié)果如表2 所示,靜脈注射烏頭堿后大鼠均可出現(xiàn)室性心律失常,與模型組相比,馬錢苷元高劑量組和陽性藥胺碘酮組大鼠出現(xiàn)心律失常的潛伏期明顯延長(P <0.05),并有效縮短心律失常的持續(xù)時間(P <0.05)。結(jié)果表明,馬錢苷元高劑量組大鼠對烏頭堿誘發(fā)大鼠心律失常有較好的拮抗作用,低劑量組效果不明顯。

    表2 馬錢苷元對烏頭堿誘發(fā)大鼠心律失常潛伏期和持續(xù)時間的影響(±s,n = 10)Tab. 2 Influence of loganetin on incubation period and duration of arrhythmia induced by aconitine in rats(±s,n = 10)

    表2 馬錢苷元對烏頭堿誘發(fā)大鼠心律失常潛伏期和持續(xù)時間的影響(±s,n = 10)Tab. 2 Influence of loganetin on incubation period and duration of arrhythmia induced by aconitine in rats(±s,n = 10)

    注:與模型組比較,*P <0.05,**P <0.01;與胺碘酮組比較,#P <0.05,##P <0.01

    組別 潛伏期/ s 持續(xù)時間 / s模型組 82.2 ± 37.1 1 090.3 ± 281.4胺碘酮組 138.5 ± 58.0* 553.5 ± 192.2**馬錢苷元低劑量組(1 mg/kg) 106.3 ± 47.6 883.8 ± 222.5##馬錢苷元高劑量組(10 mg/kg) 146.5 ± 69.3* 767.9 ± 213.7*#F 2.989 9.512 0.043 7 9.17×10-5 P

    2.3 分子對接

    將馬錢苷元和利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)、胺碘酮(amiodarone)、維拉帕米(verapamil)與SCN5A、ADRB1、KCNH2 和CACNA1C 四個受體進行分子對接。配體與受體結(jié)合的構(gòu)象越穩(wěn)定能量越低,相互作用的可能性越大,結(jié)合能≤-1.2 kcal/mol 作為篩選標準,結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol時則視為配體與受體有較好的活性[15]。

    由圖1 可知,馬錢苷元和利多卡因、胺碘酮的結(jié)合能接近。馬錢苷元和利多卡因均可與SCN5A 中93位絲氨酸(Ser)形成氫鍵(圖2A 和2B);馬錢苷元與KCNH2 中810 位天冬酰胺(Asn)和858 位異亮氨酸(Ile)形成氫鍵,胺碘酮與KCNH2 中810 位Asn 和854 位Ser 形成氫鍵(圖2C 和2D)。結(jié)果表明馬錢苷元與SCN5A 和KCNH2 均具有較好的結(jié)合能力,與前者的結(jié)合更穩(wěn)定。

    圖1 分子對接結(jié)果氣泡圖Fig. 1 Bubble diagram of molecular docking

    圖2 藥物與受體相互作用分析Fig. 2 The analysis of the interaction between drugs and receptors

    3 討論

    從中醫(yī)的角度來說,心律失常屬于“心悸”“胸痹”“心痛”等范疇,多由于臟腑氣血陰陽虛損、內(nèi)傷七情、氣滯血瘀交互作用致心失所養(yǎng)、心脈失暢而引起[16-17]。許多化學藥品可誘導不同類型的心律失常,常用于制備快速性心律失常模型的藥物有氯仿、烏頭堿、氯化鋇、哇巴因、異丙腎上腺素等[18]。氯仿作用于心肌細胞,使心室不應(yīng)期不規(guī)則地延長、復(fù)極不均一性增加。其誘發(fā)室顫機制可能是刺激植物性神經(jīng)及其遞質(zhì)釋放或腎上腺髓質(zhì)分泌大量兒茶酚胺,激活腎上腺素β 受體有關(guān)[19]。烏頭堿誘發(fā)心律失常的機制較為復(fù)雜,可激活心肌細胞Na+通道,加速Na+離子內(nèi)流,促使細胞膜去極化,形成一源或多源性異位節(jié)律而誘發(fā)心律失常[20]。本研究選擇此兩種模型作為基礎(chǔ)探討馬錢苷元的抗心律失常作用。研究結(jié)果表明,馬錢苷元高劑量(10 mg/kg)具有一定的抗心律失常作用,能明顯降低氯仿所致大鼠的室顫發(fā)生率,對烏頭堿所致大鼠室上性早搏也有預(yù)防作用,能延長室早潛伏期并縮短其持續(xù)時間,低劑量(1 mg/kg)時無明顯作用。

    目前已知心律失常相關(guān)基因有60 多個,單一基因的異常表達可引發(fā)多種心律失常,而同一種心律失常與多種基因相關(guān)[21]。本研究從已知的作用通路中分別選擇SCN5A、 ADRB1、KCNH2、CACNA1C 作為分子對接的受體[22-26]。同時選擇四類抗心律失常藥物中的代表性藥物(利多卡因、普萘洛爾、胺碘酮和維拉帕米)作為配體,與馬錢苷元和受體對接的結(jié)果進行比較。發(fā)現(xiàn)馬錢苷元與SCN5A、ADRB1 和KCNH2均有較好的結(jié)合能力,與SCN5A 的結(jié)合能最佳。SCN5A 基因編碼的心臟Na+通道α 亞基(Nav1.5)是維持心肌細胞正常興奮性不可或缺的關(guān)鍵蛋白[22-23]。馬錢苷元可落入該蛋白“口袋”中,并通過1 位羥基與絲氨酸羥基形成的氫鍵,確保二者結(jié)合穩(wěn)定。表明馬錢苷元可能通過阻滯鈉通道發(fā)揮抗心律失常作用。

    4 結(jié)論

    本研究通過藥效學實驗證明了馬錢苷元抗心律失常的有效性,運用分子對接技術(shù)發(fā)現(xiàn),馬錢苷元與心律失常相關(guān)蛋白的結(jié)合位點和已上市藥物相似,與Na+通道蛋白的結(jié)合能力最佳,為馬錢苷元抗心律失常作用的開發(fā)提供了方向,但其作用機制還需進行進一步的實驗驗證。本課題組將針對心律失常不同作用通路的靶點繼續(xù)進行定性和定量分析,以期驗證馬錢苷元抗心律失常的作用機制。

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