硼對根瘤菌胞外多糖和吲哚乙酸分泌的調(diào)控研究

陳永崗，康文娟，吳芳，阿蕓，師尚禮，張翠梅，李自立

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

根瘤菌能與豆科植物共生結(jié)瘤固氮，將大氣中分子態(tài)氮轉(zhuǎn)化為氨供宿主植物吸收利用，進(jìn)而促進(jìn)宿主植物生長發(fā)育［1］。現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，根瘤菌拌種提高豆科植物生產(chǎn)力已經(jīng)成為一種常見的農(nóng)業(yè)措施［2］。然而由于宿主種類、根瘤菌種以及其他因素的影響，使根瘤菌結(jié)瘤能力千差萬別，部分根瘤菌難以高效地與宿主植物結(jié)瘤固氮，達(dá)到應(yīng)有的增產(chǎn)效果［3］。因此如何提高根瘤菌接種效率，一直是豆科植物固氮體系構(gòu)建研究的熱點。

研究發(fā)現(xiàn)，根瘤菌可以內(nèi)生于植物體內(nèi)，并運移至種子器官定殖，隨種子的萌發(fā)而優(yōu)先共生結(jié)瘤［4］。但根瘤菌在侵染宿主過程中，會誘發(fā)植物的防御反應(yīng)，減弱根瘤菌的侵染能力［5］。根瘤菌侵染宿主并侵入體內(nèi)的過程中，根瘤菌分泌的次生代謝產(chǎn)物胞外多糖和吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）扮演著重要角色，它們不僅可以減弱宿主的防御能力，促進(jìn)根瘤菌的侵染及侵入［5?6］，還可以促進(jìn)根瘤菌在植物根皮層細(xì)胞內(nèi)運移及根與根瘤菌的有效互作［7］。據(jù)報道，硼是根瘤菌固氮所必需的微量元素［8］，其在根瘤菌與宿主信號傳遞、根瘤細(xì)胞壁和膜結(jié)構(gòu)的形成等過程中發(fā)揮著重要作用［9］，它不僅對宿主植物生長有影響，還對根瘤菌侵染宿主以及侵染成功后在宿主體內(nèi)運移定殖有重要作用［10］。苗陽陽等［11］發(fā)現(xiàn)，添加外源硼可以促進(jìn)根瘤菌侵染宿主以及侵入后在宿主體內(nèi)運移定殖的數(shù)量。缺硼會減弱根瘤菌定殖能力、減少根瘤菌定殖數(shù)量并削弱固氮能力，同時也會降低根瘤菌表面多糖的形成，進(jìn)而影響其功能的發(fā)揮［12］。硼還可以促進(jìn)宿主植株及根瘤菌IAA 合成，有利于其在植物組織內(nèi)擴散和運輸［13?14］，而IAA 能增大宿主植物細(xì)胞壁膜透性，促進(jìn)養(yǎng)分釋放及根系根瘤菌侵染，同時可以降低宿主植物防衛(wèi)系統(tǒng)胞壁降解酶活性，使入侵根瘤菌易定殖于植物組織內(nèi)［5，15］。因此，闡明硼對根瘤菌分泌胞外多糖及IAA 的調(diào)控機制，對于研究硼促進(jìn)根瘤菌侵染宿主的機制，提高根瘤菌接種效率具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

根瘤菌：熒光標(biāo)記根瘤菌［Ensifer meliloti，gn5f，分離自甘農(nóng) 5 號紫花苜蓿（Medicago sativa）種子］。硼酸：購自無錫市晶科化工有限公司，含量大于99.5%。YMA 液體培養(yǎng)基：準(zhǔn)確稱取10 g 甘露醇，0.5 g 磷酸氫二鉀，0.2 g 七水硫酸鎂，0.1 g 氯化鈉，1 g 酵母粉，并調(diào)節(jié) pH 為 6.8～7.0，定容至 1 L。YMA 固體培養(yǎng)基加瓊脂：16～20 g?L?1。

1.2 最適硼濃度確定

設(shè)置硼濃度梯度為 0（CK）、0.05、1、5、10 和 100 mg?L?1，然后按濃度梯度加至 40 mL YMA 液體培養(yǎng)基，每個處理3 次重復(fù)，以上操作均在無菌操作臺內(nèi)進(jìn)行；將活化后的根瘤菌gn5f 接種于50 mL YMA 液體培養(yǎng)基，28 ℃、180 r?min?1培養(yǎng)至OD600值為0.5～0.8。取5 mL 該菌液加入上述含有不同硼濃度的40 mL YMA 液體培養(yǎng)基中，再在 28 ℃、180 r?min?1培養(yǎng)至 OD600值為 0.5～0.8，在不同時間段測定 OD600值，確定根瘤菌 gn5f 最適硼濃度。

1.3 硼處理根瘤菌gn5f 胞外多糖和IAA 的測定

1.3.1 胞外多糖的測定 采用苯酚?硫酸法測定胞外多糖［16］。步驟如下：配制上述所選最適硼濃度，添加至40 mL YMA 液體培養(yǎng)基中，對照不加硼液，每個處理3 個重復(fù)。將已培養(yǎng)至OD600值為0.5～0.8 的根瘤菌gn5f 取5 mL 加入 40 mL 液體培養(yǎng)基中，在 28 ℃、180 r?min?1培養(yǎng) 72 h 后，在 4 ℃下，15000 r?min?1離心 10 min，棄沉淀，收集上清液；將上清液轉(zhuǎn)入新的離心管，加入Sevag 試劑（氯仿?正丁醇體積比為5∶1，樣液與試劑體積比為2∶1），振蕩 30 min，然后 6000 r?min?1，離心 10 min，收集上清液，反復(fù)處理 4 次；將上清液移到另一 50 mL 離心管中，加入 3倍體積 95% 乙醇，4 ℃冰箱中浸提 12 h，4 ℃，15000 r·min?1，離心 45 min，并收集沉淀，棄上清液；在超凈工作臺內(nèi)風(fēng)干，稱重，即得粗胞外多糖含量。測定粗胞外多糖吸光度值，代入曲線方程：y=54.4858x?0.01024，R2=0.9951，計算根瘤菌gn5f 胞外多糖含量。

1.3.2 吲哚乙酸（IAA）的測定 采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測定IAA［17］。步驟如下：根瘤菌培養(yǎng)方法同上，培養(yǎng) 72 h 后，在 4 ℃下，15000 r·min?1，離心 10 min，棄沉淀，收集上清液；將上清液低溫干燥至 10～15 mL，并用鹽酸（1 mol?L?1）將 pH 值調(diào)至 2.8；轉(zhuǎn)入分液漏斗，加入 20 mL 乙酸乙酯，振蕩5 min，待分層后；轉(zhuǎn)移上層溶液于另一分液漏斗中，向下層溶液再加入乙酸乙酯提取一次，合并上層溶液于50 mL 燒瓶中，于低溫干燥濃縮至近干；用2 mL 無水乙醇溶解后盛于小試管中。于高效液相色譜儀測定IAA含量，測定條件為：進(jìn)樣量 10 uL，流動相∶甲醇∶水∶乙酸（45∶54∶1），流速0.8 mL?min?1，Eclipse Plus C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，美國Thermo fisher 公司）。

1.4 硼處理根瘤菌gn5f 蛋白質(zhì)測定及純化

根據(jù)1.3.1 的方法收集最適硼處理后的根瘤菌gn5f 的菌體，低溫保存?zhèn)溆茫焕鋬鰻顟B(tài)下取出樣品，轉(zhuǎn)移至MP振蕩管中，加入適量抽提 buffer（1% SDS，200 mmol?L?1DTT，50 mmol?L?1Tris?HCl，pH 8.8 含蛋白酶抑制劑），渦旋混勻并用高通量組織研磨儀振蕩3 次，每次40 s，裂解30 min。100 ℃下孵化10 min，置冰上冷卻。在4 ℃ 12000 r·min?1條件下，離心 20 min，取上清，加入預(yù)冷丙酮（1∶4），在?20 ℃下過夜沉淀。次日在 4 ℃、12000 r·min?1條件下，離心20 min，棄上清，向沉淀中加入90%預(yù)冷丙酮，混勻后離心棄上清，重復(fù)2 次。向沉淀中加入蛋白裂解液（8 mol?L?1尿素，含蛋白酶抑制劑），在 4 ℃ 12000 r·min?1條件下，離心 20 min，棄沉淀，留上清［18］。然后根據(jù)BCA 試劑盒（蘇州達(dá)麥迪生物醫(yī)學(xué)科技有限公司）操作測定蛋白質(zhì)濃度，并進(jìn)行SDS?PAGE 電泳［19］；取樣品各100 μg，向各樣品中加入終濃度為100 mmol·L?1三乙基碳酸氫銨緩沖液（tetraethylammonium bromide，TEAB）和 10 mmol·L?1TCEP［tris（2-carboxyethyl）phosphine］，在 37 ℃下反應(yīng) 60 min。加入終濃度 40 mmol?L?1碘乙酰胺，室溫避光反應(yīng) 40 min。加入 7 倍體積 100 mmol?L?1TEAB 和胰蛋白酶，37 ℃酶解過夜。酶切后用HLB（hydrophile lipophile balance）、陽離子固相萃取進(jìn)行脫鹽純化。

1.5 液相串聯(lián)質(zhì)譜分析

使用 Q-Exactive HF-X 質(zhì)譜儀（Thermo fisher 公司，美國）鑒定蛋白質(zhì)序列，掃描范圍為 350～1300 m?z?1，采集模式為DDA（discontinous deformational analysis）；一級質(zhì)譜分辨率為70000，最大注入時間為20 ms，AGC tar?get 為3e6，采用高能碰撞解離（high energy collision dissociation，HCD）碎裂方式；選擇母離子中信號最強的20 個進(jìn)行二級碎裂，二級分辨率 17500，AGC target 為 1e5，最大注入時間 50 ms，起始質(zhì)荷比：100 m?z?1；最小 AGC tar?get 8e3，臨界強度為1.6e5，動態(tài)排除時間18 s。液相條件為：采用C18 column 色譜柱（Thermo fisher 公司，美國），A 液：0.1%甲酸和 2% 乙腈，B 液：0.1%甲酸和 80% 乙腈，流速為 300 nL?min?1，分離時間為90 min。

1.6 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 19.0 和Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。用PEAKS Studio 8.5 進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)搜索，選擇已經(jīng)建立好的數(shù)據(jù)庫。將搜庫得到的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)重新分析，在蛋白質(zhì)層面進(jìn)行t配對檢驗，計算相應(yīng)的P-value 及差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C），以此作為顯著性指標(biāo)。根據(jù)FC 以及P-value 進(jìn)行差異蛋白質(zhì)篩選。當(dāng)FC≥1.5 且P-val?ue＜0.05 時，表示該蛋白質(zhì)表達(dá)量顯著上調(diào)；當(dāng)FC≤1 且P-value＜0.05 時，表示該蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)。并對差異蛋白進(jìn)行GO（gene ontology）功能注釋以KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 適宜硼濃度的篩選

在 20～180 min 時，適宜的硼濃度可以促進(jìn)根瘤菌 gn5f 的生長。20 min 時，硼濃度為 100 mg?L?1，根瘤菌生長速度最快，顯著大于對照（P＜0.05），其余處理與對照差異不顯著（P＞0.05）；60 和140 min 時，當(dāng)硼濃度小于10 mg?L?1，根瘤菌gn5f 生長速度與對照相比差異均不顯著（P＞0.05），其余處理生長速度較對照均差異顯著（P＜0.05），且硼濃度為 100 mg?L?1時生長速度最快；100 min 時，硼濃度為 100 mg?L?1生長速度最快，除添加 1 mg?L?1硼生長速度較對照差異不顯著（P＞0.05）外，其余處理較對照均差異顯著（P＜0.05）；180 min 時，除100 mg?L?1硼濃度處理較對照差異顯著（P＜0.05）外，其余處理較對照差異均不顯著（P＞0.05）（圖1）。

圖1 不同硼濃度對根瘤菌gn5f OD600的影響Fig.1 Effects of different boron concentrations on gn5f OD600

結(jié)合前期試驗結(jié)果［11］（100 mg?L?1硼處理根瘤菌gn5f 后接種紫花苜蓿時，根瘤菌gn5f 在紫花苜蓿體內(nèi)運移數(shù)量最多），確定根瘤菌gn5f 的最適硼濃度為100 mg?L?1。

2.2 根瘤菌gn5f 的生長曲線

對照和添加最適硼時的生長曲線均呈現(xiàn)S 型，分為延遲期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期和衰亡期。在根瘤菌的對數(shù)期，細(xì)胞數(shù)量呈幾何級數(shù)增長，細(xì)胞內(nèi)各種酶的合成也最活躍、代謝旺盛，各種物質(zhì)成分和生理特性較為一致，結(jié)合圖1 和圖2 確定后續(xù)蛋白組學(xué)取樣時間為180 min，即對數(shù)期時進(jìn)行菌體收集，以進(jìn)行后續(xù)蛋白組學(xué)的研究。添加硼與對照相比，達(dá)到相同OD600值的培養(yǎng)時間以及進(jìn)入對數(shù)期的培養(yǎng)時間均明顯縮短。說明最適硼處理顯著促進(jìn)了根瘤菌生長。由于胞外多糖以及IAA 是根瘤菌的次生代謝產(chǎn)物，根據(jù)細(xì)菌的特性，次生代謝產(chǎn)物分泌主要在穩(wěn)定期，結(jié)合最適硼處理下的生長曲線，確定后續(xù)試驗最適硼濃度處理下，根瘤菌gn5f 培養(yǎng)時間為72 h（圖2）。

圖2 硼處理前后根瘤菌gn5f 生長曲線Fig. 2 Growth curve of strain gn5f treated by boron before and after

2.3 硼對根瘤菌gn5f 產(chǎn)胞外多糖和IAA 的影響

相比對照，100 mg?L?1硼處理根瘤菌 gn5f 顯著提高了其胞外多糖和IAA 產(chǎn)量（P＜0.05），其中胞外多糖提高33.0%，IAA 提高65.9%。表明，最適硼處理根瘤菌gn5f 可顯著提高胞外多糖和IAA 含量（圖3）。

圖3 硼對根瘤菌gn5f 產(chǎn)胞外多糖和IAA 的影響Fig.3 Effect of boron on extracellular polysaccharides and IAA production of gn5f

2.4 硼處理根瘤菌gn5f 蛋白質(zhì)SDS?PAGE 電泳

各樣本電泳條帶均清晰，樣本間平行性較好。蛋白預(yù)測質(zhì)譜顯示酶解正常，色譜質(zhì)譜行為正常，可以進(jìn)行后續(xù)試驗（圖4）。

圖4 SDS-PAGE 電泳結(jié)果Fig. 4 SDS-PAGE electrophoresis results

2.5 硼處理根瘤菌gn5f 差異蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析

采用 Label free 技術(shù)，對 100 mg?L?1硼處理根瘤菌gn5f 進(jìn)行定量蛋白組學(xué)分析，共鑒定出160 個蛋白點，54 個差異表達(dá)蛋白，其中7 個蛋白表達(dá)上調(diào)，47 個蛋白表達(dá)下調(diào)。表明最適硼濃度處理根瘤菌，可引起部分蛋白表達(dá)上調(diào)和下調(diào)。

2.5.1 硼處理根瘤菌gn5f 差異蛋白GO 富集分析

根據(jù)分子功能（molecular function，MF）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）、生物過程（biological pro?cess，BP）對差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO 功能注釋，統(tǒng)計對應(yīng)差異蛋白所占的百分比（圖5）。結(jié)果表明，100 mg?L?1硼處理根瘤菌gn5f 后，差異蛋白參與的分子功能主要包括催化活性（36 個），結(jié)合（20 個）及轉(zhuǎn)運活性（7個）等；而參與的細(xì)胞組分主要有細(xì)胞組分（11 個），生物膜（5 個）及蛋白質(zhì)復(fù)合物（5 個）等；主要參與的生物過程為代謝過程（30 個），細(xì)胞過程（23 個）及定位（7個）等。結(jié)果表明，100 mg?L?1硼處理根瘤菌 gn5f 后差異表達(dá)蛋白具有多種分子功能，并參與多個生物過程（圖5）。

圖5 硼處理根瘤菌gn5f 差異表達(dá)蛋白GO 功能富集分析Fig.5 Functional enrichment analysis of boron-treated rhizobium gn5f differentially expressed protein

2.5.2 硼處理根瘤菌gn5f 差異蛋白KEGG pathway 富集分析 對差異蛋白進(jìn)行KEGG pathway 富集分析，發(fā)現(xiàn)差異蛋白分布于4 個功能區(qū)，有28 個蛋白參與代謝（全局和概覽通路），7 個參與環(huán)境信息處理（膜運輸），6 個參與細(xì)胞過程（運輸和分解代謝）、3 個參與遺傳信息處理（轉(zhuǎn)錄）及13 個未知功能（圖6）。已知功能的差異蛋白主要富集在抗生素合成、碳代謝、賴氨酸降解、丁酸脂代謝、酪氨酸代謝（tyrosine metabolism）及色氨酸代謝（trypto?phan metabolism）等代謝通路中（圖7）。其中已知功能的上調(diào)蛋白乙酰輔酶A 合成酶（A0A4R3PRU1）共參與11條代謝通路，琥珀酸半醛脫氫酶（NADP+）（A0A1Q9AU32）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotibnamide adenine di?nucleotide，NAD）依賴性琥珀酸半醛脫氫酶（A0A0Q6ZU08）各參與7 條代謝通路，且共同參與γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）代謝、丙氨酸代謝及谷氨酸代謝等與三羧酸循環(huán)有關(guān)的代謝通路。4 種上調(diào)蛋白未找到KEGG 相對應(yīng)通路。下調(diào)蛋白乙酰輔酶 A 乙酰轉(zhuǎn)移酶（A0A0N0JNE5）、烯酰輔酶 A 水合酶（A0A2M8UJS2）、脂酰輔酶 A 脫氫酶（J2L150）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依賴性琥珀酸半醛脫氫酶（A0A0Q7XRQ0）、磷酸烯醇丙酮酸合酶（A0A4Q8YPJ5）、色氨酸合酶 β 鏈（A0A2T0P7K1）等共同參與抗生素合成、碳代謝及次生代謝產(chǎn)物生物合成等通路（圖7）。

圖6 硼處理根瘤菌gn5f 差異表達(dá)蛋白KEGG 注釋統(tǒng)計Fig. 6 KEGG annotation statistics of gn5f differentially ex?pressed protein of boron-treated rhizobium

圖7 根瘤菌gn5f 差異表達(dá)蛋白數(shù)量最多的前20 個通路Fig. 7 Top 20 pathways with the most differentially ex?pressed proteins from rhizobia gn5f

綜上，硼處理根瘤菌gn5f 會引起多種蛋白表達(dá)上調(diào)和下調(diào)，且多個蛋白協(xié)同調(diào)節(jié)多個代謝通路，繼而促進(jìn)根瘤菌gn5f 生長以及其他生理代謝過程。

3 討論

3.1 根瘤菌gn5f 適宜硼濃度篩選以及生長曲線的測定

OD600值表示細(xì)菌吸收的光密度值，用來反映細(xì)菌相對生長量［20］。細(xì)菌的生長主要是指細(xì)胞數(shù)目的增多以及胞內(nèi)物質(zhì)的倍增［21］，本研究發(fā)現(xiàn)，與對照相比，硼濃度為 100 mg?L?1時，根瘤菌 gn5f OD600值增加最顯著，說明適宜的硼可以促進(jìn)該根瘤菌生長［11］。Mon?tanari 等［22］發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌在受到環(huán)境脅迫時，會誘發(fā)體內(nèi)生理應(yīng)激反應(yīng)，包括蛋白質(zhì)復(fù)合物的重組以及代謝物質(zhì)變化，以此來適應(yīng)微生態(tài)環(huán)境的變化，本研究表明，硼脅迫誘發(fā)了根瘤菌的響應(yīng)機制，使體內(nèi)某些代謝途徑或酶發(fā)生變化，繼而使生長加快，對數(shù)期縮短。根瘤菌的繁殖和個體的生長依賴于胞內(nèi)物質(zhì)的合成和加倍［23］，研究發(fā)現(xiàn)原核生物體內(nèi)的類鈣調(diào)蛋白與細(xì)胞分裂以及細(xì)胞內(nèi)多種酶的活性有關(guān)［24］，硼可能是通過激活該蛋白，促進(jìn)細(xì)胞分裂以及與生長相關(guān)酶的活性，間接促進(jìn)根瘤菌的繁殖和生長。

3.2 硼對根瘤菌gn5f 產(chǎn)胞外多糖和IAA 的影響

硼是固氮細(xì)菌固氮所必需的微量元素，在根瘤菌與宿主共生關(guān)系建立、表面多糖形成以及根瘤菌固氮等過程中發(fā)揮著重要作用［6，8］。缺硼可以減弱根瘤菌定殖能力，影響根瘤菌表面多糖形成及功能發(fā)揮［11，25］，同時減少IAA 含量和根瘤菌侵染宿主時的侵染位點［26］。本研究發(fā)現(xiàn)，最適硼可以顯著促進(jìn)根瘤菌gn5f 胞外多糖和IAA 含量，Martin 等［27］也發(fā)現(xiàn)，適宜的硼酸會影響白鏈球菌碳水化合物的能量代謝，且可以導(dǎo)致根瘤菌Botrytiscinerea胞質(zhì)內(nèi)溶物：可溶性糖的泄露［28］，同時硼還可以影響多種酶的活性，其中大多數(shù)與能量底物代謝有關(guān)［29］。因此，推測硼對根瘤菌胞外多糖和IAA 產(chǎn)量的影響，可能主要是通過影響碳水化合物代謝過程及各種關(guān)鍵酶活性，繼而影響其合成以及分泌。

3.3 硼對根瘤菌gn5f 差異蛋白組學(xué)的影響

硼是固氮細(xì)菌固氮所必需的微量元素，在根瘤菌與宿主共生關(guān)系建立，促進(jìn)根瘤菌侵染宿主以及促進(jìn)根瘤菌次生產(chǎn)物胞外多糖和IAA 合成等過程中扮演著重要作用，硼處理根瘤菌接種苜蓿后，根瘤菌對苜蓿的影響已有研究［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，硼處理下根瘤菌gn5f 蛋白組學(xué)發(fā)生變化，其中一些重要的參與γ-氨基丁酸（GABA）代謝、丙氨酸代謝，天冬氨酸和谷氨酸代謝的蛋白表達(dá)上調(diào)，包括乙酰輔酶A 合成酶、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依賴性琥珀酸半醛脫氫酶及琥珀酸半醛脫氫酶（NADP+）。乙酰輔酶A 合成酶與生物體內(nèi)物質(zhì)和能量的生成有關(guān)，主要參與能量代謝及物質(zhì)合成相關(guān)的代謝通路［30］。丙氨酸可以轉(zhuǎn)化為丙酮酸，丙酮酸可以進(jìn)入三羧酸循環(huán)（tri?carboxylic acid cycle，TCA）。天冬氨酸和谷氨酸在特定條件下可以相互轉(zhuǎn)換，谷氨酸主要參與γ-氨基丁酸、蛋白質(zhì)以及葡萄糖等的合成；γ-氨基丁酸與丙酮酸在特定條件下可以生成琥珀酸半醛和丙氨酸，琥珀酸半醛在琥珀酸半醛脫氫酶（NADP+）的作用下生成琥珀酸，進(jìn)入三羧酸循環(huán)，該過程稱為γ-氨基丁酸（GABA）旁路［31］。有研究發(fā)現(xiàn)，在許多細(xì)菌體內(nèi)存在兩種類型的琥珀酸半醛脫氫酶，其活性分別依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nico?tinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP）或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）［32］。表明硼處理根瘤菌 gn5f 后煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依賴性琥珀酸半醛脫氫酶、乙酰輔酶A 合成酶、琥珀酸半醛脫氫酶（NADP+）蛋白表達(dá)上調(diào)，琥珀酸半醛脫氫酶（NADP+）Gab D（W6S1U0）蛋白表達(dá)下調(diào)均與上述代謝通路有關(guān)。上述代謝過程可以為根瘤菌生長及胞外多糖和IAA 的合成提供各種前體物質(zhì)和能量。

烯酰輔酶A 水合酶可以催化脂肪酸β 氧化中水分子可逆地順式加成到a，β 不飽和硫酯雙鍵上［33?34］，脂酰輔酶A 脫氫酶主要參與脂肪酸β 氧化，是脂肪酸β 氧化中一種重要的酶［35］，本研究中烯酰輔酶A 水合酶和脂酰輔酶A脫氫酶表達(dá)均顯著下調(diào)，表明硼可以減弱或抑制根瘤菌gn5f 的脂肪酸β 氧化。

磷酸烯醇丙酮酸合酶與細(xì)菌糖異生路徑中磷酸烯醇式丙酮酸的合成有關(guān)［36］。乙酰輔酶A 乙酰轉(zhuǎn)移酶在多種酶存在條件下可以將乙酰輔酶A 轉(zhuǎn)化成多聚3-羥丁酸［Poly（3-hydroxybutyrate），PHB］，而PHB 是根瘤菌的儲能物質(zhì)［37］。色氨酸合酶β 鏈可以催化吲哚乙酸合成色氨酸［38］。這些蛋白表達(dá)下調(diào)，表明硼處理會抑制該根瘤菌的糖異生途徑、儲能物質(zhì)合成以及色氨酸的分解。

可見，100 mg?L?1硼處理根瘤菌gn5f，會引起與三羧酸代謝有關(guān)的蛋白表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)三羧酸循環(huán)，同時會引起與糖異生、脂肪酸β 氧化以及氨基酸代謝有關(guān)的蛋白表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而抑制這些代謝通路。表明硼對根瘤菌gn5f 胞外多糖及IAA 的調(diào)控是一個復(fù)雜的反應(yīng)過程，是多個蛋白協(xié)同作用的結(jié)果。

3.4 硼對根瘤菌gn5f 產(chǎn)胞外多糖和IAA 的調(diào)控探究

根據(jù)100 mg?L?1硼處理根瘤菌gn5f 后上調(diào)差異蛋白主要富集的代謝通路以及已知根瘤菌胞外多糖合成的調(diào)控［39］，推測硼可能是通過促進(jìn)GABA 旁路代謝、丙酮酸代謝以及谷氨酸代謝等與三羧酸循環(huán)有關(guān)的代謝通路，為胞外多糖合成提供能量以及所需要的各種糖類物質(zhì)（D-半乳糖殘基，D-葡萄糖殘基以及D-葡萄糖醛酸等），繼而促進(jìn)胞外多糖的合成。具體機制有待進(jìn)一步研究證明。

100 mg?L?1硼處理根瘤菌gn5f 后，上調(diào)表達(dá)蛋白促進(jìn)了色氨酸代謝通路，推測硼促進(jìn)色氨酸合成，然后色氨酸經(jīng)吲哚-3-乙酰胺（indole-3-acetamide，IAM）或吲哚-3-丙酮酸途徑合成吲哚乙酸（IAA），繼而促進(jìn)IAA 合成。

4 結(jié)論

篩選的根瘤菌 gn5f 最適硼濃度為 100 mg?L?1；100 mg?L?1硼可顯著促進(jìn)根瘤菌 gn5f 胞外多糖和 IAA 的合成；最適硼處理根瘤菌gn5f 后共鑒定到54 個差異表達(dá)蛋白，7 個上調(diào)蛋白，47 個下調(diào)蛋白。推測硼可能是通過促進(jìn)丙酮酸代謝、GABA 旁路代謝，谷氨酸代謝等代謝通路，為胞外多糖合成提供能量以及所需要的各種單糖（D-半乳糖殘基，D-葡萄糖殘基以及D-葡萄糖醛酸等），繼而促進(jìn)胞外多糖的合成；IAA 合成機制為：硼通過促進(jìn)色氨酸的合成，然后色氨酸在相關(guān)酶的作用下經(jīng)吲哚-3-丙酮酸或吲哚-3-乙酰胺（IAM）途徑合成吲哚乙酸（IAA），繼而促進(jìn)IAA 合成。