響應(yīng)面法優(yōu)化藜麥秸稈飼料發(fā)酵工藝的研究

余肖飛 ，郭曉農(nóng) ，2，3*，張妍 ，劉子威 ，張喜聞 ，徐可新 ，吳治勇

（1. 西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；2. 西北民族大學生物醫(yī)學研究中心生物工程與技術(shù)國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030；3. 西北民族大學生物醫(yī)學研究中心中國?馬來西亞國家聯(lián)合實驗室，甘肅 蘭州 730030）

藜麥（Chenopodium quinoa）隸屬藜科藜屬，原產(chǎn)于南美洲安第斯山脈地區(qū)［1?2］。藜麥適應(yīng)性強［3］，其秸稈含大量纖維素和木質(zhì)素［4］，具有多種開發(fā)利用價值，逐漸成為植物飼料領(lǐng)域的研究熱點。藜麥種植地區(qū)包括歐洲的英國、法國、意大利，非洲的馬里和肯尼亞以及北美洲的美國和加拿大等國家和地區(qū)［5］。我國藜麥種植最早地區(qū)為西藏地區(qū)可追溯到20 世紀90 年代［6］。2019 年數(shù)據(jù)顯示，中國藜麥種植面積和總產(chǎn)量已躍居世界第三，主要種植區(qū)域覆蓋河西走廊、伊犁河谷、蒙古高原?烏蘭察布、柴達木盆地、四川盆地和云貴高原等地區(qū)。其中甘肅省種植面積最廣，達 3333 hm2。其次為內(nèi)蒙古 2333 hm2、青海 1667 hm2、云南 1667 hm2、山西 1333 hm2、河北 1000 hm2［7］。我國對藜麥的研究仍處于育種、種植和初加工階段，對其秸稈營養(yǎng)價值及應(yīng)用的研究相對較少［8］，主要涉及多糖、黃酮、皂苷等化學成分［9?10］。侯召華等［11］研究表明，藜麥皂苷具備抗氧化、抗腫瘤、抑菌、免疫調(diào)節(jié)等藥理活性，胡一晨等［12］研究表明，藜麥還富含維生素、必需氨基酸、礦物質(zhì)（K、P、Mg、Ca、Zn、Fe）等養(yǎng)分。而其秸稈中亦含有有益于動物健康的天然抑菌成分。藜麥具有突出的飼用價值［13］。藜麥秸稈相對于其他作物秸稈含有較高的纖維素、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)及脂肪等成分。而動物對纖維素和木質(zhì)素的消化吸收利用的效率低。目前有關(guān)藜麥秸稈的開發(fā)應(yīng)用研究較少，藜麥秸稈除了焚燒取暖之外，一般被棄置。本試驗利用微生物發(fā)酵技術(shù)改善藜麥秸稈飼料品質(zhì)，同時通過響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）優(yōu)化處理。試驗選用產(chǎn)自甘肅省蘭州市紅古區(qū)的隴藜1 號，10 月刈割獲取藜麥秸稈作為試驗材料，試驗采用乳酸菌、釀酒酵母兩種微生物發(fā)酵藜麥秸稈，乳酸發(fā)酵可降低飼料pH 值，增加乳酸含量，降低丁酸含量，可抑制飼料中的致病菌和腐敗菌生長，改善動物腸道功能［14］；酵母是兼性微生物，厭氧發(fā)酵能夠獲得酒精、甘油、酶等代謝產(chǎn)物，耗氧發(fā)酵可以獲得酵母細胞或細胞組成成分［15］，在協(xié)同發(fā)酵［16］中可提供利于乳酸發(fā)酵的條件，開展不同微生物對藜麥秸稈飼料營養(yǎng)成分含量影響及差異分析，一方面變廢為寶，合理利用作物秸稈，另一方面通過不同菌種的合理搭配，進行協(xié)同發(fā)酵，提高發(fā)酵效率甚至可改善其養(yǎng)分結(jié)構(gòu)。在發(fā)酵過程中，添加酶制劑黑曲霉（Aspergillus niger），其可產(chǎn)生纖維素酶、α?半乳糖苷酶和淀粉酶，在有效降低藜麥秸稈中纖維素及木質(zhì)素的同時，也提高了飼料中淀粉、脂肪等養(yǎng)分的含量。纖維素和木質(zhì)素含量明顯降低的發(fā)酵飼料對胃蛋白酶及胰蛋白酶的酶解抗性作用減弱，使藜麥秸稈更加蓬松柔軟，適口性更好，而有利于動物主動采食，更有利于生物降解和動物消化吸收［17］。目前，種植藜麥的農(nóng)戶直接利用藜麥秸稈飼養(yǎng)綿羊等家畜，其飼用價值和經(jīng)濟效益沒有得到很好的開發(fā)，本研究為藜麥秸稈的進一步開發(fā)利用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用蘭州市紅古區(qū)種植的隴藜1 號藜麥秸稈，自然晾曬至表面枯黃，無霉變及腐敗跡象；發(fā)酵劑選用酵母菌（安琪酵母股份有限公司，2018-11-25）、乳酸桿菌（成都臻植生物科技有限公司，2019-02-13）與黑曲霉（濟寧玉園生物科技，2019-09-15）。

1.2 試驗設(shè)計

試驗始于2018 年5 月中旬，包括乳酸菌發(fā)酵、混合菌發(fā)酵以及黑曲霉對比發(fā)酵3 部分。乳酸菌發(fā)酵、混合菌發(fā)酵中均采用L（934）正交原理設(shè)計試驗，設(shè)定發(fā)酵時間、含水量和菌劑添加量（混合比例）3 個因素，每個因素下設(shè) 3 個水平（表 1?2）。李鳳玲等［18］研究表明，黑曲霉產(chǎn)酶豐富，可用于發(fā)酵飼料，其最佳發(fā)酵條件在70%含水量，25 ℃下培養(yǎng)42 h 以上，故在乳酸菌發(fā)酵的基礎(chǔ)上做關(guān)于黑曲霉對藜麥秸稈飼料的簡單對比試驗，以試驗組別4 作為空白對照，發(fā)酵時間為72 h，設(shè)計見表 3。

1.3 秸稈發(fā)酵

將藜麥秸稈經(jīng)晾曬、風干后，利用秸稈粉碎機粉碎至粉末狀，每試樣取100 g。在無菌條件下按照試驗要求調(diào)節(jié)水分與菌劑含量，充分攪拌混勻，裝入密封袋內(nèi)壓實密封，置于24.5 ℃下發(fā)酵3～7 d 后，進行營養(yǎng)成分測定分析。

表1 乳酸菌發(fā)酵藜麥秸稈飼料正交試驗因素水平Table 1 Levels of factors in orthogonal experiment of lactic acid bacteria fermenting quinoa straw feed

表2 混合菌發(fā)酵藜麥秸稈飼料正交試驗因素水平Table 2 Factors of orthogonal experiment on fermentation of quinoa straw feed by mixed bacteria

表 3 1～19 組試驗處理Table 3 Pilot group 1-19 test treatment

1.4 測定指標

1.4.1 粗蛋白（crude protein，CP）含量的測定 精確稱取1.0 g 試樣（凱氏定氮法），置于消化管中，加硫酸銅0.4 g，無水硫酸鉀6.0 g，混合均勻，加入濃硫酸20 mL 與瓷片兩小片，于電熱爐上加熱，待內(nèi)容物全部炭化，至泡沫停止后，加強火力，至溶液呈透明的深藍色，加熱2 h，冷卻后使用海能K9842 自動凱氏定氮儀（濟南）進行測定。

1.4.2 粗脂肪（ether extract，EE）含量測定 精確稱取3.0 g 試樣（索氏抽提法），置于濾紙筒內(nèi)，放入濾紙架，用磁鐵吸住濾紙架。干燥恒重抽提杯，記錄抽提杯質(zhì)量，加入60 mL 石油醚。使用海能SOX406 脂肪測定儀（濟南）進行抽提。將抽提杯取下，置于干燥箱內(nèi)，烘干水分及剩余有機溶劑，移入干燥器中冷卻后稱量，計算脂肪含量。

1.4.3 粗纖維（crude fiber，CF）含量測定 精確稱取2.0 g 試樣（酸堿法），將樣品放入已稱量過的干燥過濾坩堝。使用海能F800 纖維測定儀（濟南）測定。烘箱干燥后稱重，計算粗纖維含量。

1.4.4 可溶性糖（soluble sugar，SS）含量測定 配制蔗糖標準溶液（紫外可見分光光度法），使用島津UV-1800紫外分光光度計（上海）測定相對應(yīng)的吸光度，繪制蔗糖標準曲線。精確稱取1.0 g 試樣，加入6～10 mL 蒸餾水，沸水浴30 min，3500 r·min?1離心10 min 取上清液，重提兩次。定容至50 mL，用島津UV-1800 紫外分光光度計測定吸光度。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010 整理數(shù)據(jù)繪圖，采用Design-Expert V8.0.6 進行響應(yīng)面作圖，各項指標測定重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官品質(zhì)測定

參照相關(guān)標準［19］制定適用于本試驗的感官質(zhì)量評定標準（表4）。

表4 感官質(zhì)量評定標準Table 4 Criteria for sensory quality assessment

根據(jù)表4 感官質(zhì)量評定標準對19 組（3 個平行）共計57 個樣本進行測評（圖1）。其中試驗組1～9 為乳酸菌發(fā)酵，10～18 為混合菌劑發(fā)酵，19 為黑曲霉發(fā)酵。試驗組10 評分最高，為8.2 分。而組3 有輕微霉味；組4 臭味較重；組6 有輕微臭味；組13 和19 出現(xiàn)發(fā)粘和輕微板結(jié)現(xiàn)象；黑曲霉發(fā)酵中也出現(xiàn)較重霉味，以上組別飼料感官品質(zhì)均不理想（圖1）。其余飼料則質(zhì)地松軟，有適宜的酸香味。隨著含水量的升高和發(fā)酵時間的延長，會加大霉變的概率。當含水量為55%左右，發(fā)酵時間在3～5 d 時，飼料具有良好的感官品質(zhì)。

圖1 藜麥秸稈發(fā)酵飼料感官品質(zhì)測評Fig.1 Sensory evaluation of fermented feed from quinoa straw

2.2 營養(yǎng)性指標三維響應(yīng)曲面線

乳酸菌單獨發(fā)酵藜麥秸稈粗纖維變化范圍為20.7%～23.1%；乳酸菌與酵母菌混合制劑發(fā)酵下藜麥秸稈粗纖維變化范圍為20.03%～20.71%。在相同含水量及發(fā)酵時間下混合發(fā)酵要比乳酸菌單菌降解纖維素作用更為明顯。而兩種不同的發(fā)酵劑作用下，纖維素最低含量出現(xiàn)在含水量為60%左右，發(fā)酵時間在72～100 h 的條件下，此時單菌發(fā)酵乳酸菌添加量為0.95 g左右，而混合發(fā)酵時混合比例為1.25，即非等比混合（圖2）。

圖2 藜麥秸稈飼料粗纖維三維響應(yīng)面曲線Fig.2 Three-dimensional response surface curve of crude fiber of quinoa straw feed

未發(fā)酵的藜麥秸稈粗蛋白含量在10.14%～13.14%，單菌發(fā)酵后的藜麥秸稈粗蛋白含量在13.45%～15.26%，混合發(fā)酵粗蛋白變化范圍為13.72%～15.03%，粗蛋白平均含量提高了約2.70%（圖3）。從圖中可以明顯看出，含水量對粗蛋白含量有較大的制約，含水量過高或者過低都會使粗蛋白含量下降，最佳的含水量在58%左右。而在168 h 內(nèi)粗蛋白含量與發(fā)酵時間呈正相關(guān)。

圖3 藜麥秸稈飼料粗蛋白三維響應(yīng)面曲線Fig.3 Three-dimensional response surface curve of feed crude protein of quinoa straw

粗脂肪含量在發(fā)酵過程中波動范圍較小，未發(fā)酵的藜麥秸稈粗脂肪含量2.50%～2.60%，發(fā)酵后藜麥秸稈飼料粗脂肪含量可提高0.24%～0.31%。無論單一菌劑發(fā)酵還是混合菌劑發(fā)酵，對藜麥秸稈飼料中粗脂肪含量的提高有輕微的促進作用（圖4）。

圖4 藜麥秸稈飼料粗脂肪三維響應(yīng)面曲線Fig.4 Three-dimensional response surface curve of ether extract in quinoa straw feed

乳酸菌發(fā)酵藜麥秸稈可溶性糖含量在21.54%～24.10%，混合菌發(fā)酵后的可溶性糖含量變化范圍為24.50%～27.10%，混合制劑對可溶性糖含量的提高要優(yōu)于單一菌劑，平均提高了3%左右，可溶性糖含量的變化隨發(fā)酵時間的延長呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢，峰值出現(xiàn)在發(fā)酵末期。出現(xiàn)這種情況的原因可能為發(fā)酵初期乳酸菌與酵母菌的新陳代謝會消耗部分糖分作為能源物質(zhì)（圖5）。

圖5 藜麥秸稈飼料可溶性糖三維響應(yīng)面曲線Fig.5 Three-dimensional response surface curve of soluble sugar in quinoa straw feed

2.3 黑曲霉對藜麥秸稈發(fā)酵飼料品質(zhì)的影響

黑曲霉有助于降解纖維素與可溶性糖含量的提高，藜麥秸稈經(jīng)黑曲霉發(fā)酵后粗纖維含量降低了1.88%，粗脂肪下降了0.02%，粗蛋白含量減少了0.04%，可溶性糖含量上升了1.30%（圖6）。圖中標出標準誤差線。黑曲霉發(fā)酵中營養(yǎng)指標含量分別為CF（20.47±1.41）%，EE（2.49±0.01）%，CP（13.80±1.16）%，SS（24.80±1.42）%；空白對照（乳酸發(fā)酵）組中營養(yǎng)指標含量分別為CF（22.35±1.52）%，EE（2.51±0.03）%，CP（14.20±1.56）%，SS（23.50±1.12）%；但在感官品質(zhì)上，黑曲霉發(fā)酵的藜麥秸稈飼料與對照組的藜麥秸稈發(fā)酵飼料的感官品質(zhì)均不佳，具有較濃的霉味與惡臭味。

圖6 黑曲霉發(fā)酵對各營養(yǎng)指標的影響Fig. 6 The effect of Aspergillus Niger fermentation on the nu?tritional indexes

3 討論

粗纖維是飼料中質(zhì)地堅硬粗糙、適口性差、且牲畜飼用后不易消化的部分，它遍及植物莖葉和秕殼之中［20］。粗纖維中不僅富含纖維素，還包括一些半纖維素與木質(zhì)素等，木質(zhì)素是完全不被家畜消化的物質(zhì)。粗纖維雖然消化利用率及營養(yǎng)價值低，但在家畜日糧中是不可缺少的成分。因為它體積大［21］，對家畜胃腸容積有一定擴充作用，家畜食后有飽腹感［22］，對家畜育肥有利。粗纖維有刺激胃腸蠕動的機械作用，有利于消化和排糞正常［23］。若飼料中含粗纖維量過多，不僅影響飼料品質(zhì)，而且家畜不能直接利用粗纖維中的能量，進而影響家畜健康和畜產(chǎn)品品質(zhì)。藜麥秸稈作為優(yōu)質(zhì)飼料的原料之一，其粗纖維含量低于玉米（Zea mays）秸稈，麥秸等，經(jīng)乳酸菌、酵母菌發(fā)酵后粗纖維含量明顯降低。試驗結(jié)果表明乳酸發(fā)酵中纖維素最低含量為20.7%，波動范圍為2.40%；混合發(fā)酵纖維素含量最低為20.03%，波動范圍為0.68%；可見乳酸菌與酵母菌協(xié)同發(fā)酵處理藜麥秸稈中粗纖維含量明顯優(yōu)于單菌發(fā)酵，而且混合發(fā)酵波動范圍小，纖維素降解效果更穩(wěn)定。同時混合發(fā)酵組中最優(yōu)發(fā)酵群出現(xiàn)在混合比例1.25（非等比混合）處，前期酵母發(fā)酵占主導(dǎo)地位為乳酸發(fā)酵創(chuàng)造有利條件，后期進行協(xié)同發(fā)酵，這也體現(xiàn)出混合發(fā)酵的優(yōu)勢。酵母菌的添加為乳酸菌提供了良好的厭氧環(huán)境，保障了發(fā)酵過程中乳酸菌的新陳代謝。

粗蛋白質(zhì)包含真蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)含氮物（non-protein nitrogen，NPN）兩部分［24］，是家畜生長、發(fā)育、繁殖及生命活動所必需的基礎(chǔ)養(yǎng)分。在家畜飼養(yǎng)中，蛋白質(zhì)應(yīng)保障供給，特別是處在生長期的幼畜和產(chǎn)奶母畜。黃開武［25］研究表明，家畜日糧中如果粗蛋白質(zhì)含量缺乏，會使家畜的健康、生長、發(fā)育、繁殖、生產(chǎn)水平及畜產(chǎn)品品質(zhì)受到不同程度的影響。嚴重時，還會使家畜發(fā)生貧血、瘦弱、抗逆能力減退，乃至發(fā)病、死亡。基于這種狀況，在家畜飼養(yǎng)過程中必須使日糧粗蛋白質(zhì)的含量達到一定的水平并保持。本試驗乳酸菌發(fā)酵中粗蛋白含量為13.45%～15.26%，變化范圍為1.81%，混合發(fā)酵中粗蛋白含量為13.72%～15.03%，變化范圍為1.31%。雖然乳酸發(fā)酵中粗蛋白含量出現(xiàn)了最高水平，但相比之下混合發(fā)酵波動范圍小，效果穩(wěn)定，結(jié)果更具代表性，且混合發(fā)酵最低粗蛋白含量高出乳酸發(fā)酵0.27%，這也表明混合發(fā)酵對粗蛋白的保留能力強。出現(xiàn)混合發(fā)酵峰值低于乳酸發(fā)酵的可能原因有：1）混合發(fā)酵中酵母菌的新陳代謝會消耗部分蛋白質(zhì)；2）酵母菌的厭氧反應(yīng)不產(chǎn)蛋白及相關(guān)酶類。此外各種飼料蛋白質(zhì)含量及品質(zhì)差異較大［26］，而藜麥秸稈作為植物性秸稈飼料在蛋白質(zhì)含量和品質(zhì)上明顯劣于動物性飼料，也不及油餅類飼料、豆科植物及禾本科植物，故在后續(xù)實際生產(chǎn)中需補充其他蛋白質(zhì)飼料。

粗脂肪包括真脂和類脂（如固醇、磷脂等）。脂肪在家畜飼養(yǎng)中用以維持體溫與供給體內(nèi)各器官運動時所需要的能量，同時也是脂溶性維生素的攜帶者，若日糧中脂肪缺乏則影響這一類維生素的吸收和利用，容易導(dǎo)致家畜的脂溶性維生素缺乏癥。而日糧中脂肪酸的不足會妨礙家畜生長或引起死亡。飼料中添加適量的脂肪不僅能夠改善適口性，還能產(chǎn)生“額外的熱能效應(yīng)”的有益作用。飼料中粗脂肪含量逾越5%，容易引起腹瀉或過肥，對于反芻畜還會抑制瘤胃微生物的繁殖，從而降低其消化功能［27］。本試驗乳酸發(fā)酵中粗脂肪峰值為2.67%，混合發(fā)酵中峰值為2.91%，經(jīng)發(fā)酵后粗脂肪含量可提高0.24%～0.31%，首先藜麥秸稈作為植物性秸稈飼料，其含脂量是非常低的，但經(jīng)微生物發(fā)酵后其脂含量小幅提高，出現(xiàn)這種結(jié)果與本試驗所選用的酵母菌種具產(chǎn)脂作用有必然的關(guān)系。

可溶性糖作為貯存在植物體組織中的營養(yǎng)物質(zhì)，也是家畜所必需的養(yǎng)分?？扇苄蕴呛扛叩涂珊饬磕骋恢参镄燥暳系膶嶋H應(yīng)用價值，除提供家畜所需主要的能量外，也參與維持體內(nèi)細胞滲透壓平衡。本試驗研究結(jié)果顯示乳酸菌發(fā)酵可溶性糖含量在21.54%～24.10%，峰值為24.10%；混合發(fā)酵可溶性糖含量為24.50%～27.10%，峰值為27.10%，相比之下混合發(fā)酵提高可溶性糖含量的作用更顯著。在發(fā)酵過程中，乳酸對糖的理論轉(zhuǎn)化率為50%［28］，乳酸菌和酵母菌雖消耗部分可溶性糖以供自身正常生理代謝，發(fā)酵后可溶性糖含量提高是罕見的，以后可做進一步探究。

此外，試驗過程中發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵藜麥秸稈飼料受含水量影響極為明顯，在含水量為65%以上時，極易受到雜菌感染，飼料顏色發(fā)黑且有霉味，原因可能是在含水量過高時，會影響乳酸菌糖化效果，導(dǎo)致發(fā)酵飼料溫度提升快而高，不利于乳酸菌生長，導(dǎo)致優(yōu)勢菌種群發(fā)生變化，而協(xié)同發(fā)酵有利于對這種局面的調(diào)控。以后的試驗進程中可對菌株的選擇、搭配與使用做更細致的考慮。我國于2014 年才開始大面積種植藜麥，但是對于藜麥收獲后的副產(chǎn)品藜麥秸稈的利用率卻極低，研究表明藜麥有較高的開發(fā)利用價值，藜麥秸稈作為發(fā)酵飼料的利用也許是未來發(fā)展藜麥副產(chǎn)品生產(chǎn)的一個關(guān)鍵點。

4 結(jié)論

藜麥秸稈相對于玉米、小麥（Triticum aestivuml）秸稈，其具有蛋白含量高、粗纖維含量低，更接近于家畜日糧需要量的優(yōu)點。藜麥秸稈生物量積累和品質(zhì)表現(xiàn)均表明，藜麥秸稈是一種很有潛力的飼草原料。發(fā)酵后：1）混合發(fā)酵降解纖維素效果明顯，發(fā)酵后最低纖維素含量為20.03%；2）藜麥秸稈飼料較未發(fā)酵的藜麥秸稈粗蛋白平均含量提高了約2.70%；3）粗脂肪含量提升0.24%～0.31%；4）發(fā)酵后藜麥秸稈飼料平均可溶性糖含量提高了約3%。最佳發(fā)酵組為含水量為55%～60%，發(fā)酵時間為（120±10）h，混合比例為1～1.25。本試驗通過微生物發(fā)酵改善了藜麥秸稈的營養(yǎng)成分，達到了可飼用標準；同時也使藜麥秸稈飼料的品質(zhì)得以提高。結(jié)果表明適當乳酸菌發(fā)酵藜麥秸稈增加了其粗蛋白與可溶性糖含量，這與乳酸菌能夠提高原料中蛋白的消化利用率的作用相符［29］，同時降解粗纖維作用明顯。協(xié)同發(fā)酵對發(fā)酵過程中霉變也起到一定的抑制作用。本研究為后續(xù)藜麥秸稈發(fā)酵飼料的進一步開發(fā)利用奠定了一定的基礎(chǔ)。