干細(xì)胞修復(fù)牙槽骨缺損：微環(huán)境認(rèn)知新進(jìn)展

楊艷蘭，徐普

中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院口腔中心/海南省口腔醫(yī)學(xué)中心種植科，?？?570208

牙周疾病常造成牙槽骨缺損，自體骨移植及骨替代材料植入為臨床常規(guī)的治療方法。自體骨移植具有良好的骨誘導(dǎo)性、骨傳導(dǎo)性及成骨性，但不能避免感染、出血、神經(jīng)損傷、供體不足及移植后骨吸收等一系列問題，而骨替代材料則缺乏骨誘導(dǎo)性且存在免疫炎癥反應(yīng)等問題[1]。雖然自體骨移植仍是修復(fù)骨缺損的“金標(biāo)準(zhǔn)”[2]，但現(xiàn)有診療技術(shù)仍有諸多缺陷無法克服。近年來，基于干細(xì)胞的組織工程替代療法成為研究熱點(diǎn)?？谇唤M織是干細(xì)胞的重要來源之一，基于干細(xì)胞的牙周組織再生治療已部分應(yīng)用于牙槽骨缺損的治療，但干細(xì)胞移植后的存活情況及療效仍有較多不確定因素，限制了其在臨床上的應(yīng)用[3]。本文從微環(huán)境角度著重介紹了局部微環(huán)境對干細(xì)胞功能的影響及調(diào)控作用，并介紹了干細(xì)胞衍生的外泌體在牙周組織尤其是牙槽骨缺損修復(fù)中的治療潛能，旨在強(qiáng)調(diào)微環(huán)境對干細(xì)胞的影響，以探索最佳治療方案。

1 口腔來源干細(xì)胞在牙周組織再生中的作用

常見的口腔來源干細(xì)胞有牙周膜干細(xì)胞(PDLSCs)、根尖乳頭干細(xì)胞(SCAPs)、牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞[包括乳牙牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞(SHED)、恒牙牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞(DPSC)]等?？谇粊碓锤杉?xì)胞具有良好的免疫耐受性，可安全地用于同種異體移植。除免疫調(diào)節(jié)功能外，口腔來源干細(xì)胞還可通過抑制氧化應(yīng)激水平而減輕移植后的免疫炎癥反應(yīng)。干細(xì)胞移植后，可產(chǎn)生類似于牙骨質(zhì)及牙周膜的結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)新骨形成，促進(jìn)血管新生，進(jìn)而恢復(fù)部分牙齒功能、替代牙槽骨缺失、重建受損的唾液腺功能、促進(jìn)下頜骨髁突再生、治療髁突變性、促進(jìn)缺失或損傷舌組織再生、恢復(fù)部分舌組織功能等[4](表1)。

表1 口腔來源干細(xì)胞修復(fù)牙周缺損的主要作用Tab.1 The main role of oral-derived stem cells in repairing periodontal defects

然而，干細(xì)胞治療的療效受供體和受體微環(huán)境的雙重影響。了解病變微環(huán)境對干細(xì)胞的影響及其可能機(jī)制，優(yōu)化干細(xì)胞治療策略，是目前基于干細(xì)胞的口腔再生療法面臨的重大挑戰(zhàn)。

2 干細(xì)胞誘導(dǎo)牙周組織再生的微環(huán)境調(diào)控機(jī)制

微環(huán)境是指移植干細(xì)胞的周圍結(jié)構(gòu)及成分，包括鄰近細(xì)胞和組織、激素、各種生長因子/細(xì)胞因子、代謝狀態(tài)等[5]。充足的血供、分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細(xì)胞增殖與分化，是微環(huán)境中影響干細(xì)胞再生修復(fù)的關(guān)鍵。在牙周炎微環(huán)境中，干細(xì)胞在胰島素樣生長因子1(IGF-1)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等生長因子介導(dǎo)下可促進(jìn)血管新生，誘導(dǎo)肉芽組織形成；在成骨分化過程，TNF-α可通過核因子κB(NF-κB)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，增加細(xì)胞外基質(zhì)的礦化，并上調(diào)骨礦化相關(guān)基因的表達(dá)，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2)、堿性磷酸酶(ALP)、成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子(Runx2)等。此外，TGF-β1可通過哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路刺激Runx2及骨鈣素(OPG)的產(chǎn)生，促進(jìn)成纖維細(xì)胞合成膠原并成骨分化。OPG在白細(xì)胞介素(IL)-6的刺激下，可正反饋誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的骨礦化[6]。

細(xì)胞外基質(zhì)的合成與礦化是影響牙周再生的重要因素。干細(xì)胞可在降低基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-1、MMP-8表達(dá)的同時(shí)增加基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)-2、TIMP-4的表達(dá)，使成骨分化過程中的細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)處于最佳狀態(tài)[7]。此外，血液中的單核細(xì)胞及輔助T細(xì)胞(Th)2可通過分泌IL-10負(fù)向調(diào)節(jié)NF-κB受體活化子配體(RANKL)，活化T細(xì)胞核因子1(NFATC1)及巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)，促進(jìn)OPG的表達(dá)，發(fā)揮減少骨吸收、降低破骨細(xì)胞分化及活化的作用，同時(shí)還可減輕Th1引起的炎癥反應(yīng)，改善炎癥微環(huán)境。

此外，口腔來源干細(xì)胞介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)在牙周組織再生中也發(fā)揮著重要作用。Toll樣受體(TLR)是參與非特異性免疫的一類重要蛋白質(zhì)分子。在炎癥微環(huán)境下，TLR3、TLR4激動(dòng)劑可增強(qiáng)牙源性干細(xì)胞的免疫抑制作用，從而抑制外周血單核細(xì)胞的增殖。此外，干細(xì)胞分泌的IL-6、IL-8等炎性因子亦可影響TLR的表達(dá)。還有研究發(fā)現(xiàn)，牙源性干細(xì)胞的免疫功能受微環(huán)境中TGF-β、TNF-α、γ干擾素(IFN-γ)等生長因子的調(diào)節(jié)；此外，牙源性干細(xì)胞還可通過激活補(bǔ)體系統(tǒng)促進(jìn)牙周組織再生[8]。

最后，干細(xì)胞定植后，在微環(huán)境中IL-6、抑瘤素M(OSM)等細(xì)胞因子介導(dǎo)下，可通過酪氨酸激酶3(JAK3)、信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3)等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分化為成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等，并分泌牙骨質(zhì)蛋白1抗體(CEMP1)和Ⅰ型膠原蛋白(COL-Ⅰ)，分別合成牙根牙骨質(zhì)及牙周韌帶的膠原纖維，促進(jìn)牙周組織的再生[9]。圖1展示了干細(xì)胞的微環(huán)境調(diào)控機(jī)制。

圖1 干細(xì)胞誘導(dǎo)牙周組織再生的微環(huán)境調(diào)控機(jī)制Fig.1 Microenvironmental regulation mechanism of stem cells inducing periodontal tissue regeneration

3 微環(huán)境對干細(xì)胞功能的影響

移植微環(huán)境，如宿主激素水平、代謝狀態(tài)及免疫調(diào)節(jié)等，均為影響干細(xì)胞功能的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)：(1)當(dāng)干細(xì)胞移植至損傷部位時(shí)，可通過抑制局部IFN-γ及TNF-α等炎性因子，促進(jìn)骨缺損的修復(fù)；(2)在關(guān)節(jié)炎發(fā)病時(shí)短期應(yīng)用硼替佐米可改善炎性微環(huán)境，增強(qiáng)干細(xì)胞的治療效果；(3)控制糖尿病患者的血糖水平，可提高干細(xì)胞療效；(4)干細(xì)胞移植前輸注T細(xì)胞，可改善免疫介導(dǎo)的干細(xì)胞異位骨再生[10]等。

3.1 激素水平 激素是微環(huán)境的重要組成部分，可影響干細(xì)胞的增殖、分化及成骨-破骨細(xì)胞間的平衡。宿主微環(huán)境中的激素水平處于最佳平衡狀態(tài)時(shí)，可促進(jìn)干細(xì)胞誘導(dǎo)的牙周組織再生。如17β-雌二醇在微環(huán)境中表皮細(xì)胞生長因子(EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子2(bFGF2)等生長因子的刺激下，可促進(jìn)干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化[11]。但是，雌激素缺乏可造成活性氧大量聚集，從而誘導(dǎo)干細(xì)胞凋亡[12-13]；而雌激素過高，則可影響干細(xì)胞表面的雌激素受體(ER)-α、ER-β的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞衰老[14]。甲狀旁腺激素可促進(jìn)干細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)分化，減輕移植后的氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)干細(xì)胞的存活[15]。如Pang等[16]、Zhao等[17]的體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)增加甲狀旁腺激素濃度，可通過c-Jun氨基末端激酶(JNK)及p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)磷酸化途徑調(diào)節(jié)SCAPs的成牙/成骨分化，增強(qiáng)干細(xì)胞的成骨分化能力。糖皮質(zhì)激素常用于干細(xì)胞的體外成骨誘導(dǎo)，然而，過量的糖皮質(zhì)激素可抑制干細(xì)胞增殖，降低其成骨潛能，導(dǎo)致骨質(zhì)丟失[18-19]。胰島素是由胰島β細(xì)胞分泌的一種蛋白質(zhì)激素，可激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶(PI3K/Akt)通路，調(diào)節(jié)線粒體呼吸，促進(jìn)干細(xì)胞存活[20]；類胰島素生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP)可通過JNK及細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)信號通路增強(qiáng)牙髓干細(xì)胞的牙本質(zhì)再生潛能[21]。

雖然宿主微環(huán)境中的各種激素對干細(xì)胞的再生潛能至關(guān)重要，但具體的修復(fù)機(jī)制及最佳的激素水平仍需進(jìn)一步探索。

3.2 代謝狀態(tài) 代謝狀態(tài)也是影響干細(xì)胞功能的重要因素[22-23]。干細(xì)胞在體內(nèi)主要通過糖酵解及有氧分解獲得能量，然而葡萄糖濃度過高可損害干細(xì)胞的功能及成骨分化能力，促進(jìn)細(xì)胞衰老，增加骨質(zhì)疏松、骨折及牙周疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)，如糖尿病合并牙周炎患者的PDLSCs分化潛能明顯降低。在糖尿病患者中，直接注射干細(xì)胞治療骨質(zhì)疏松的療效較差，但在輸注干細(xì)胞前注射胰島素，改善機(jī)體血糖水平后則可明顯提高其療效[10]。高脂血癥可影響牙骨質(zhì)的合成代謝，抑制ALP、Runx2及miR-29a-3p基因的表達(dá)，從而引起骨整合受損、骨質(zhì)丟失，最終抑制干細(xì)胞的成骨分化潛能[24]。Liu等[25]的研究發(fā)現(xiàn)，牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞(GMSCs)可調(diào)節(jié)高脂血癥牙周炎小鼠的脂質(zhì)代謝，抑制炎癥，促進(jìn)新骨形成及牙槽骨高度升高，改善牙周組織的再生。此外，GMSCs還可抑制高脂血癥相關(guān)的牙周炎小鼠模型中M1巨噬細(xì)胞的活化，通過免疫作用調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)骨再生[26]。因此，宿主的代謝狀態(tài)直接影響移植后的細(xì)胞功能?；颊咴诩?xì)胞移植前調(diào)整至最佳的血糖、血脂水平，可極大地提高干細(xì)胞的療效。

3.3 免疫調(diào)節(jié) 炎癥微環(huán)境是干細(xì)胞介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)及骨愈合的關(guān)鍵[18,27]?？谇粊碓锤杉?xì)胞在微環(huán)境中各種生長因子/細(xì)胞因子的介導(dǎo)下，可調(diào)控T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等的功能，影響骨和牙體組織再生[28]。牙髓干細(xì)胞表達(dá)的C3a、C5a可激活補(bǔ)體系統(tǒng)，影響干細(xì)胞的增殖及活化?？谇粊碓锤杉?xì)胞的再生及免疫調(diào)節(jié)功能受微環(huán)境中TGF-β、TNF-α、IFN-γ等細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)。TNF-α、IFN-γ可通過抑制T細(xì)胞活性降低干細(xì)胞的成骨分化潛能，但高濃度的TNF-α可誘導(dǎo)干細(xì)胞凋亡。有研究將干細(xì)胞注射至牙周缺損部位后，觀察到明顯的牙周組織再生，且局部IL-1β、TNF-α、IFN-γ等的表達(dá)也明顯降低[29]。當(dāng)T細(xì)胞與干細(xì)胞同時(shí)注射時(shí)可明顯促進(jìn)骨缺損的修復(fù)[30-31]。

口腔來源干細(xì)胞與免疫系統(tǒng)相互作用，且受微環(huán)境中各種炎性因子的調(diào)節(jié)。但口腔來源干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能與其在不同口腔組織中再生潛能的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

4 優(yōu)化干細(xì)胞治療策略

雖然干細(xì)胞在牙周疾病治療中已顯示出諸多優(yōu)勢，但影響干細(xì)胞療效的因素較多且不易控制。優(yōu)化或恢復(fù)宿主正常微環(huán)境，增強(qiáng)干細(xì)胞對病變微環(huán)境的耐受能力，恢復(fù)受損干細(xì)胞的功能，提高干細(xì)胞療效仍是目前的研究重點(diǎn)[10,32-33]。

4.1 預(yù)防性干預(yù) 如女性絕經(jīng)后預(yù)防性應(yīng)用雌激素可提高干細(xì)胞的成骨潛能，預(yù)防骨質(zhì)疏松；改善高血糖狀態(tài)可延緩干細(xì)胞衰老，增強(qiáng)成骨能力，增加骨密度，降低骨折的風(fēng)險(xiǎn)；口服白藜蘆醇可改善干細(xì)胞的成骨潛能，調(diào)節(jié)成骨-破骨平衡，減少牙槽骨質(zhì)丟失，抑制炎癥及氧化應(yīng)激損傷[34]；抗炎治療可恢復(fù)干細(xì)胞功能，有利于牙周炎患者牙槽骨及牙組織的治療等。

4.2 根據(jù)微環(huán)境狀態(tài)選擇適當(dāng)?shù)母杉?xì)胞類型 骨再生治療可首選骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)；骨質(zhì)疏松者可選擇雌激素缺乏供體的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADMSCs)，較BMSCs更易適應(yīng)病變微環(huán)境[27,35]；牙周疾病者可首選PDLSCs[36]。此外，可通過基因修飾增強(qiáng)干細(xì)胞對病變微環(huán)境的耐受能力，增強(qiáng)干細(xì)胞功能[37]，如在雌激素缺乏骨缺損小鼠中，通過基因修飾可上調(diào)移植干細(xì)胞miR-26a基因的表達(dá)，促進(jìn)骨缺損愈合。最后，還可通過體外干預(yù)增強(qiáng)干細(xì)胞的功能，如組蛋白甲基化抑制劑(DZNep)可增強(qiáng)病變微環(huán)境中干細(xì)胞的成骨潛能[38]，小分子化合物可增強(qiáng)干細(xì)胞再生潛能[39]，低濃度IFN-γ可增強(qiáng)干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能[40]、促進(jìn)成骨等。

5 總結(jié)與展望

雖然干細(xì)胞在口腔組織損傷修復(fù)中有著巨大的應(yīng)用前景，但不論是內(nèi)源性修復(fù)還是外源性移植，均受到局部微環(huán)境的調(diào)控。本文從微環(huán)境與干細(xì)胞相互作用的角度出發(fā)，較全面地概述了干細(xì)胞修復(fù)口腔組織的微環(huán)境調(diào)控機(jī)制，并強(qiáng)調(diào)了機(jī)體內(nèi)環(huán)境，包括激素、代謝、免疫等因素對干細(xì)胞功能的影響。然而，如何在病變微環(huán)境中提高干細(xì)胞移植的療效仍然面臨諸多挑戰(zhàn)。

通過基因修飾提高外源性干細(xì)胞的功能或改善病變微環(huán)境均為有效可行的策略。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，外泌體對組織缺損修復(fù)的潛在作用優(yōu)于單分子藥物、細(xì)胞、合成脂質(zhì)體等[41]。此外，外泌體具有易于獲取及儲存，安全性高，對受體微環(huán)境的適應(yīng)能力較強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在骨和口腔組織尤其是牙槽骨的缺損治療中潛力巨大[42-43]。下一步可研究干細(xì)胞衍生的外泌體用于口腔組織再生治療的可行方法，以促進(jìn)無細(xì)胞治療策略的建立，并揭示干細(xì)胞治療的機(jī)制。此外，還需建立特定的口腔疾病模型，進(jìn)一步了解干細(xì)胞影響供體和宿主微環(huán)境的生物學(xué)過程，加深對干細(xì)胞治療時(shí)微環(huán)境調(diào)控的認(rèn)識，優(yōu)化并構(gòu)建更有效的治療策略。