Toll樣受體基因組特征與直腸癌臨床病理及免疫參數(shù)的相關性分析

李昂，仵紅嬌，謝俞寧，賈禎賢，李佳瑩，張雪梅*

1華北理工大學公共衛(wèi)生學院，河北唐山 063210；2華北理工大學生命科學學院，河北唐山 063210

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是世界上第三大常見癌癥，也是導致癌癥患者死亡的第二大原因[1]。美國癌癥協(xié)會的流行病學調查顯示，直腸癌在CRC中占比達35%。作為先天免疫的重要組成部分，炎癥是癌癥發(fā)生和進展的標志性特征[2]。Toll樣受體(Toll like receptors，TLRs)是特殊的模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)，可誘導免疫細胞表面相關分子的表達而激活免疫應答途徑，還可與相應配體結合激活炎癥通路[3]。據(jù)統(tǒng)計，除環(huán)境危險因素(包括肥胖、缺乏運動、不良飲食、飲酒和吸煙)外，1/3的直腸癌是由遺傳因素誘導發(fā)生的[4-5]，而單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)在人類的可遺傳變異中較為常見。調節(jié)區(qū)和3'非翻譯區(qū)SNP可分別通過調節(jié)與轉錄因子或miRNA的結合，從而對靶基因調控產生影響[6]。因此，具有潛在功能的SNP可能會增加機體對癌癥的易感性。有研究發(fā)現(xiàn)，TLR3調控區(qū)基因多態(tài)性與腸道病毒71型(EV71)重癥感染的易感性相關[7]，而腸道感染也是CRC的誘因之一[8]。鑒于TLRs在腫瘤中的重要作用，本研究通過查閱文獻并利用生物信息學方法篩選出5個潛在的功能SNP位點，探討其對CRC發(fā)病風險的影響，以期為CRC的防治及早期診斷提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 本研究采用病例對照的研究策略。選取2008－2016年在華北理工大學附屬唐山市工人醫(yī)院和華北理工大學附屬唐山市人民醫(yī)院住院治療的480例經組織病理學確診且采血前未接受放化療的原發(fā)性直腸癌患者設為病例組，另隨機選取同期在唐山地區(qū)進行體檢的480名健康者設為對照組，排除與病例組有血緣關系、有腫瘤家族史、接受放射治療或者抗癌化學藥物治療的個體。本研究經華北理工大學倫理審查委員會批準(2019021)，所有參與者均簽署知情同意書。

1.2 SNP篩選 從dbSNP及Ensembl數(shù)據(jù)庫中提取TLR家族成員基因多態(tài)數(shù)據(jù)信息，篩選位于啟動子區(qū)及3'非翻譯區(qū)且在中國漢族人群中最小等位基因頻率＞0.05的遺傳變異。使用TRANSFAC和SNPinfo Web Serve軟件分別對篩選出的SNP進行轉錄因子結合和miRNA結合能力預測，最終確定研究位于啟動子區(qū)的TLR3 rs5743303、TLR4 rs1927914、TLR5 rs1640816，以及3'非翻譯區(qū)的TLR4 rs7869402、TLR7 rs3853839多態(tài)。

1.3 基因分型 使用DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取外周血DNA。針對TLR3 rs5743303、TLR5 rs1640816和TLR7 rs3853839多態(tài)，使用TaqMan探針法進行基因分型。PCR反應體系包括1×Taq PCR MasterMix Ⅱ(美國ABI公司)2 μl、探針0.065 μl和基因組DNA 1 μl(＞10 ng)，最后用雙蒸水補至5 μl，使用ABI 7900HT Fast Real-Time PCR system進行檢測。針對TLR4 rs1927914和rs7869402多態(tài)，使用聚合酶鏈反應限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術進行基因分型。引物序列如下：TLR4 rs1927914上游5'-TAGCATGAGA AATGAGGAAGTAAGGG-3'，下游5'-GAGCTATG ATGAGGATTGAAAATGTGG-3'；TLR4 rs7869402

上游5'TGGGATCCCTCCCCTGTAGC-3'，下游5'-AGGAGCATTGCCCAACAGG-3'。PCR反應體系包括上下游引物各0.1 μl(10 mmol/L)，cDNA 1 μl(＞10 ng)，2×Taq PCR Starmix 3 μl(北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司)，最后用雙蒸水補至6 μl。PCR擴增條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進行30個循環(huán)；然后72 ℃延伸5 min。使用AluⅠ和NsiⅠ限制性核酸內切酶(NEB公司)對TLR4 rs1927914和rs7869402的PCR產物進行酶切。酶切產物經2.5%瓊脂糖凝膠電泳進行基因型判斷。為提高基因分型的準確度，隨機選取10%的樣本進行重復實驗，結果一致。

1.4 統(tǒng)計學處理 利用GEPIA在線數(shù)據(jù)平臺分析直腸癌中TLRs的表達及其與直腸癌預后的相關性，ESTIMATE算法分析TLR3表達與免疫細胞評分的相關性，TIMER數(shù)據(jù)庫評估直腸癌TLR3表達及拷貝數(shù)變異與免疫細胞浸潤的相關性。從TCGA數(shù)據(jù)庫獲取直腸癌患者的轉錄組數(shù)據(jù)和臨床信息，利用WilcoxTest函數(shù)評估TLRs基因表達與病理分期的關系，KEGG通路和GO功能富集分析TLR3相關差異基因的表達[利用R語言中的基因集變異分析(GSVA)軟件包完成]。采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用χ2檢驗比較病例組與對照組研究對象的基本特征及基因型分布的差異，非條件logistic回歸分析TLRs遺傳變異與直腸癌發(fā)病風險的關系。所有統(tǒng)計檢驗均為雙側概率檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 TLRs與直腸癌臨床病理的關系 GEPIA在線數(shù)據(jù)平臺分析結果顯示，TLR3在直腸癌組織中的表達明顯低于正常組織(P＜0.05)，且其低表達與預后不良相關(HR=0.26，95%CI 0.094～0.87，P=0.021)。TLR4、TLR5和TLR7在直腸癌組織與正常組織中的表達差異無統(tǒng)計學意義，且與直腸癌預后無關(P＞0.05)。TLRs的表達與直腸癌臨床病理分期無相關性(P＞0.05)(圖1)。

2.2 TLRs遺傳變異與直腸癌易感性的關系 兩組年齡中位數(shù)均為60歲，年齡、性別以及吸煙和飲酒占比等基本資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，表1)。

TLRs遺傳變異各基因型分布與直腸癌易感性的關系如表2所示。病例組TLR3 rs5743303 AA、AT和TT基因型頻率分別為69.8%(335/480)、26.7%(128/480)和3.5%(17/480)，對照組分別為76.7%(368/480)、20.8%(100/480)和2.5%(12/480)。非條件l o g i s t i c 回歸分析結果顯示，與T L R 3 rs5743303 AA基因型相比，AT或TT基因型攜帶者的直腸癌發(fā)病風險明顯增加(OR=1.43，95%CI 1.07～1.90)。而TLR4 rs1927914、TLR4 rs7869402、TLR5 rs1640816和TLR7 rs3853839遺傳變異并不影響直腸癌的發(fā)病風險(P＞0.05)。

表1 病例組與對照組基本資料比較[例(%)]Tab.1 Comparison of basic data between patients and controls[n(%)]

表2 Toll樣受體遺傳變異與直腸癌易感性的關系[例(%)]Tab.2 Relations of TLR genetic variation to the susceptibility of rectal cancer [n(%)]

圖1 TLRs在直腸癌中的表達及其與病理分期和預后的相關性分析Fig.1 Expression of TLRs in rectal cancer tissues and its correlation with the pathological stage and prognosis of rectal cancer

TLR3 rs5743303遺傳變異與直腸癌發(fā)病風險的分層分析結果如表3所示。性別分層結果顯示，男性AT或TT基因型攜帶者的直腸癌發(fā)病風險是AA基因型攜帶者的1.47倍(P=0.041)，在女性中未見該變異影響直腸癌發(fā)病風險(P=0.202)。年齡分層結果顯示，低年齡(≤60歲)AT或TT基因型攜帶者發(fā)生直腸癌的風險較高(OR=1.64，95% CI 1.08～2.47，P=0.019)，而在高齡(＞60歲)者中差異無統(tǒng)計學意義(P=0.185)。吸煙和飲酒分層結果顯示，與AA基因型攜帶者相比，攜帶AT或TT基因型的吸煙者(OR=2.42，95% CI 1.37～4.38)和飲酒者(OR=2.70，95% CI 1.52～4.80)發(fā)生直腸癌的風險較高(P=0.002，P=0.001)。

2.3 TLR3與免疫特征參數(shù)的關系 ESTIMATE算法分析結果顯示，TLR3表達與直腸癌免疫評分呈正相關(r=0.23，P=0.038，圖2A)。TIMER數(shù)據(jù)庫分析結果顯示，TLR3表達與CD8+T細胞的相關性最強(r=0.537，P＜0.001)，與巨噬細胞無相關性(r=0.008，P=0.921，圖2C)；體細胞TLR3拷貝數(shù)變異與B細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突細胞的浸潤程度呈弱相關或無相關性(P＜0.05，圖2B)。

表3 TLR3 rs5743303基因分型與直腸癌發(fā)病風險的分層分析Tab.3 Stratified analysis of TLR3 rs5743303 genotypes with the risk of rectal cancer

圖2 TLR3與免疫特性參數(shù)的相關性分析Fig.2 Correlation analysis between TLR3 and immune characteristic parameters

2.4 直腸癌中TLR3的GO功能和GSVA富集分析對TCGA數(shù)據(jù)庫中直腸癌的RNA測序數(shù)據(jù)進行GO功能分析，結果顯示，TLR3高表達主要與受體配體活性、抗原結合、免疫球蛋白受體結合、生長因子和細胞因子等相關基因功能的改變有關(圖3A)。GSVA富集分析結果顯示，TLR3相關通路主要富集在細胞凋亡、自然殺傷細胞介導的細胞毒性、磷脂代謝及自噬調節(jié)等與代謝或免疫相關的途徑(圖3B)。

3 討 論

直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一。我國癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，國人直腸癌發(fā)病率逐年上升且呈年輕化趨勢[9]。盡管手術、靶向治療及放化療已在直腸癌的治療中取得了滿意的療效，但患者5年總體生存率仍較低[10]。因此，對直腸癌發(fā)病及預后的影響因素進行探索，以發(fā)現(xiàn)直腸癌易感因素及預后因素，有助于改善直腸癌患者的生存質量及預后情況。

圖3 TLR3表達對基因功能和信號通路的影響Fig.3 Effect of TLR3 expression on gene function and signal pathway

TLR s是特殊的模式識別受體，可通過參與不同的病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)和損傷相關分子模式(damage associated molecular patterns，DAMP)引起促炎因子、趨化因子和干擾素的釋放而激活炎癥通路，進而啟動免疫反應[11]。TLRs可增加血管通透性，也可通過細胞毒性T細胞和自然殺傷細胞殺傷腫瘤細胞，從而發(fā)揮抑制腫瘤的作用[12]。在免疫治療時代，腫瘤的發(fā)展受其內在特征及外在腫瘤微環(huán)境的共同影響。TLRs活化后經信號轉導產生炎性因子并激活樹突細胞[13]，而位于腫瘤微環(huán)境中的樹突細胞可發(fā)揮抗原提呈作用，使自然殺傷細胞和T細胞活化，從而發(fā)揮細胞毒性作用，進而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[14]。

Bonnin等[15]發(fā)現(xiàn)，TLR3 mRNA及蛋白在肝癌組織中的表達均低于癌旁組織，且TLR3表達下調與肝癌患者生存率降低有關。對神經母細胞瘤和食管癌的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤實質中TLR3高表達與預后良好相關[16-17]，在非小細胞肺癌早期，TLR3高表達具有抑癌作用且與較高的總體生存率明顯相關[18]。TLR3激動劑是一種強效免疫調節(jié)劑，可通過激活TLR3的表達來刺激抗原呈遞細胞，從而活化腫瘤特異性T細胞，以及將骨髓抑制細胞和腫瘤相關巨噬細胞的表型從免疫抑制轉為免疫支持[19-21]。本研究生物信息學分析結果顯示，先天免疫基因TLR3在直腸癌中低表達且與預后不良有關。腫瘤基因表達譜可以量化腫瘤微環(huán)境中的免疫活性[22]。本研究通過ESTIMATE和TIMER分析發(fā)現(xiàn)，TLR3與腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞浸潤具有一定的相關性，且GSVA富集分析結果也顯示TLR3低表達可抑制自然殺傷細胞介導的細胞毒性通路，從而發(fā)揮促進腫瘤發(fā)展的作用。

TLRs基因中存在的SNP可能會損害其功能并破壞促炎與抗炎細胞因子之間的平衡，增加慢性炎癥和癌癥的發(fā)生風險[23-25]。TLR3 SNP影響癌癥易感性，可作為評估癌癥發(fā)生風險的潛在生物標志物[26]。與野生型相比，TLR3突變型與口腔癌和鼻咽癌的發(fā)病風險明顯相關[27]。雖有研究表明TLR3基因多態(tài)性與乳腺癌的發(fā)病風險無關，但TLR3的表達與乳腺癌的侵襲性有關[28]。迄今為止，關于TLR3 SNP與直腸癌易感性關系的報道較少。本研究結果顯示，TLR3低表達是直腸癌的危險因素，且TLR3 rs5743303的遺傳變異與直腸癌發(fā)病風險增加明顯相關，但直腸癌中TLR3 rs5743303遺傳變異是否導致基因差異表達，尚需進一步研究驗證。

既往研究發(fā)現(xiàn)，SNP可能通過破壞TLR4信號轉導而增加慢性炎癥和癌癥的發(fā)生風險[29]，但尚未發(fā)現(xiàn)TLR4 rs1927914遺傳變異與肺癌[30]、前列腺癌[31]、肝細胞癌[32]和胃癌[33]之間有任何明顯關聯(lián)。本研究亦未發(fā)現(xiàn)TLR4 rs1927914遺傳變異與直腸癌發(fā)病風險有關。據(jù)報道，TLR5在多種癌癥中表達并在癌變中起作用[34-36]。Chen等[37]發(fā)現(xiàn)，TLR5遺傳變異與人類乳腺癌易感性存在密切關系。與其他TLR家族成員不同，TLR5在腸道上皮細胞中高度表達，并在宿主抵抗腸道細菌感染中發(fā)揮關鍵作用[38]。本研究結果顯示，TLR5 rs1640816遺傳變異與直腸癌發(fā)病風險無相關性。有研究發(fā)現(xiàn)，炎癥性腸病患者與對照組TLR7 rs3853839等位基因頻率無明顯差異[39]。本研究亦未發(fā)現(xiàn)TLR7 rs3853839 G＞C多態(tài)性與直腸癌發(fā)病風險有任何關聯(lián)。

除遺傳因素外，腫瘤的發(fā)生也與環(huán)境因素有關。流行病學研究表明，吸煙可能誘發(fā)表觀遺傳改變[40-41]，是直腸癌發(fā)病的適度危險因素[42-43]。本研究結果顯示，至少攜帶一個TLR3 rs5743303 T等位基因的男性和低年齡者具有較高的直腸癌發(fā)病風險，且吸煙、飲酒可增加個體罹患直腸癌的風險，提示直腸癌的發(fā)生主要是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結果。

綜上所述，本研究結果表明，TLR3低表達可能通過抑制免疫細胞活性及免疫相關途徑促進直腸癌的發(fā)生與不良預后，且TLR3遺傳變異可能增加個體罹患直腸癌的風險，但其具體作用機制尚需進一步研究證實。