齊墩果酸對hiPSCs衍生心肌細胞成熟的促進作用及機制

謝敏，周琴,2，顏亮，葉亮，張心愿，許皓，易勤，譚彬，田杰，朱靜*

1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院兒科研究所/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室/國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心(重慶)/兒童發(fā)育重大疾病國家國際科技合作基地/兒科學(xué)重慶市重點實驗室，重慶 400014；2電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦女兒童中心醫(yī)院/成都市婦女兒童中心醫(yī)院檢驗科，成都 611731；3重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院檢驗科/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室/國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心(重慶)/兒童發(fā)育重大疾病國家國際科技合作基地/兒科學(xué)重慶市重點實驗室，重慶 400014

世界衛(wèi)生組織的最新數(shù)據(jù)表明，心血管疾病(CVD)引起的死亡人數(shù)占全球1/3以上[1]。盡管采取了相應(yīng)的治療措施，但心肌不能自我更新，因此受損的心肌無法修復(fù)及再生。干細胞療法的出現(xiàn)為心臟修復(fù)及再生提供了一種新的視角。從成體干細胞到胚胎干細胞(ESC)，適合的干細胞來源一直備受關(guān)注。誘導(dǎo)多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)是2006年Takahashi等[2]通過對體細胞重編程導(dǎo)入4種轉(zhuǎn)錄因子(Oct3/4、Sox2、c-Myc及Klf4)產(chǎn)生的可自我更新且具有多向分化潛能的干細胞。利用患者PSCs衍生的心肌細胞進行移植不僅有望補充受損心肌，且不會發(fā)生免疫排斥。人誘導(dǎo)多能干細胞(hiPSCs)主要通過調(diào)節(jié)Wnt信號通路，并經(jīng)過乳酸無糖培養(yǎng)基純化而分化為心肌細胞[3]。但是，目前hiPSCs衍生的心肌細胞(hiPSC-CMs)在結(jié)構(gòu)及功能上類似于胎兒心肌細胞[4]，移植至成年心臟后可能導(dǎo)致心律不齊，影響療效。因此，增強hiPSC-CMs的成熟度有利于提高其臨床應(yīng)用效果。在心肌細胞成熟過程中，選擇性剪接(AS)扮演了重要角色，胚胎和成年心肌細胞通過不同剪接表達不同的同工型蛋白[5]。丙酮酸激酶(PK)是糖酵解過程中最后一個限速酶，在心肌成熟過程中AS開關(guān)打開，PK由2型(PKM2)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)?型(PKM1)[6]。有研究表明，過表達PKM1可增加線粒體活性[7]，而高PKM2/PKM1比值可抑制氧化磷酸化[8]，因此促進PK同工型轉(zhuǎn)換可能促進心肌細胞的成熟。齊墩果酸(OA)是天然的五環(huán)三萜類化合物，具有保肝[9]、抗炎[10]、神經(jīng)保護[11]、抗糖尿病[12]、心臟保護[13]等多種藥理作用。有研究發(fā)現(xiàn)，OA可促進PKM2向PKM1的同工型轉(zhuǎn)換[14]，也可影響細胞凋亡、細胞周期停滯[15]及細胞分化[16]等過程。本研究通過在hiPSC-CMs成熟過程中加入OA并進行分析，探討了OA在hiPSC-CMs成熟過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑 hiPSC細胞系、PSCeasy人多潛能干細胞消化液、PGM1人多潛能干細胞培養(yǎng)基均購自北京賽貝生物技術(shù)有限公司；基質(zhì)膠購自美國康寧公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、乳酸鈉、OA購自美國Sigma公司；CHIR99021和IWP2購自美國Selleck公司；無糖RPMI 1640、Tryple Express干細胞消化液、含胰島素及不含胰島素的B27購自美國Thermo Fisher Scientific公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、EDU-488細胞增殖檢測試劑盒購自中國碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、裂解緩沖液、細胞周期檢測試劑盒購自中國凱基公司；線粒體紅色熒光探針(Mito-Tracker Red CMXRos)購自中國翌圣生物科技公司；心肌肌鈣蛋白T(cTnT)一抗、縫隙連接蛋白43(Cx43)一抗、兔二抗購自英國Abcam公司；Nanog、Sox2、α-輔肌動蛋白(α-actinin)一抗購自美國Proteintech公司；PKM1、PKM2一抗購自美國CST公司；MFN2一抗購自美國Santa Cruz公司；β-actin一抗、鼠二抗購自中國中杉金橋公司；配膠試劑盒購自中國雅酶公司；引物TNNI3、MYH6、MYH7購自中國擎科生物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 hiPSCs的培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化及分組 hiPSCs培養(yǎng)于基質(zhì)膠包被的孔板，用PGM1培養(yǎng)基維持細胞未分化狀態(tài)，待細胞長至80%～90%時用PSCeasy消化液消化傳代。在12孔板上進行細胞誘導(dǎo)，當細胞長至100%時，以RPMI 1640培養(yǎng)基+不含胰島素B27為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在誘導(dǎo)第0天添加CHIR99021(6 μmol/L)培養(yǎng)48 h，第3天添加IWP2(5 μmol/L)培養(yǎng)48 h，第7天換RPMI 1640培養(yǎng)基+含胰島素B27，第14天換無糖RPMI 1640培養(yǎng)基+含胰島素B27+乳酸鈉(4 mmol/L)培養(yǎng)72 h后，在第17天重新接種于12孔板上。誘導(dǎo)的細胞在第7天左右開始跳動。hiPSC-CMs重接種后培養(yǎng)48 h，然后將第19天的細胞分為空白對照組(添加B27的RPMI 1640培養(yǎng)基)、DMSO組(添加DMSO 2 μl/ml)、OA加藥組(添加5 mmol/L的OA 2 μl/ml)，所有培養(yǎng)基每2 d更換1次，持續(xù)處理7 d，每個處理組至少重復(fù)3次。誘導(dǎo)分化方案見圖1。

圖1 hiPSC-CMs分化過程Fig.1 Differentiation process of the generation of hiPSC-CMs

1.2.2 Western blotting檢測各組hiPSC-CMs蛋白表達情況 分別提取各組蛋白，以30 μg上樣量進行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，然后將蛋白電轉(zhuǎn)到PVDF膜上封閉，加入PKM1、PKM2、MFN2、β-actin一抗、兔二抗或鼠二抗孵育，最后顯影得到目的蛋白條帶，并采用Image Lab軟件進行分析。

1.2.3 RT-qPCR檢測hiPSCs及hiPSC-CMs mRNA表達情況 采用Trizol法提取hiPSCs及hiPSC-CMs細胞RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以GAPDH為內(nèi)參照，在cDNA的基礎(chǔ)上進行擴增，檢測MYH6、MYH7、TNNI3的表達。RT-qPCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min預(yù)變性；95 ℃ 5 s變性、60 ℃ 30 s退火延伸，共39個循環(huán)；65 ℃ 5 s，95 ℃ 5 s獲得熔解曲線。數(shù)據(jù)分析采用2–ΔΔCt法，結(jié)果取3次平均值。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 Primer sequences for RT-qPCR assay

1.2.4 hiPSCs及hiPSC-CMs的免疫熒光染色 未分化的hiPSCs及處理的各組hiPSC-CMs接種于包被后的爬片上或共聚焦皿中進行后續(xù)染色：d-PBS搖床洗1 min×1次，4%多聚甲醛固定20 min；d-PBS洗5 min×3次，0.5% Triton通透10 min；d-PBS洗5 min×3次，5% BSA封閉30 min；加入稀釋的一抗(Nanog、Sox2、cTnT、Cx43、α-actinin)4 ℃過夜；37 ℃復(fù)溫30 min，d-PBS洗5 min×3次，加稀釋的熒光二抗，37 ℃孵育60 min；d-PBS洗5 min×3次，加稀釋的DAPI，37 ℃避光孵育60 min；d-PBS洗5 min×3次，加熒光抗猝滅劑封片。采用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察。采用α-actinin進行免疫熒光染色的圖片在共聚焦顯微鏡下進行肌節(jié)和細胞整體拍攝，采用尼康NIS-Elements系統(tǒng)，每個樣本選取3～5張圖片，統(tǒng)計每張圖片的細胞面積、圓度指數(shù)，同時每張圖片隨機選取40～50個肌小節(jié)統(tǒng)計肌節(jié)長度。結(jié)果取平均值。

1.2.5 電鏡觀察hiPSC-CMs的線粒體結(jié)構(gòu) 處理后各組細胞800 r/min離心5 min，將細胞吹散后轉(zhuǎn)移到EP管中；1200 r/min離心10 min，吸棄上清，加入戊二醛固定，進行后續(xù)電鏡觀察。

1.2.6 線粒體Mito-Tracker染色 處理的各組hiPSCCMs接種于共聚焦皿中進行染色，細胞經(jīng)d-PBS搖床洗1 min×1次，加入37 ℃預(yù)熱的染色工作液及稀釋的DPAI染液中共孵育30 min，d-PBS搖床洗3 min×3次，加入新鮮培養(yǎng)基于激光共聚焦顯微鏡下觀察。1.2.7 hiPSC-CMs細胞周期檢測 處理的各組hiPSC-CMs經(jīng)PBS振蕩混勻洗滌1次，加胰酶消化后1000 r/min離心5 min，棄上清后加冷PBS渦旋，1000 r/min離心5 min后，加入250 μl冷PBS渦旋，再加入750 μl無水乙醇4 ℃固定過夜。1000 r/min離心3 min，棄上清，加入PBS將細胞震蕩混勻洗滌后1000 r/min離心3 min×2次，加入100 μl A液37 ℃水化30 min，最后加入400 μl B液避光孵育30～60 min，然后采用流式細胞儀檢測hiPSC-CMs細胞周期。

1.2.8 EDU檢測hiPSC-CMs細胞增殖情況 處理的各組hiPSC-CMs接種于包被后的爬片上，加入EDU工作液37 ℃孵育2 h；然后加入4%多聚甲醛固定15 min，洗滌液洗5 min×3次；加入0.3% Triton孵育15 min，洗滌液洗5 min×3次；加入Click反應(yīng)液混勻，避光孵育30 min，洗滌液洗5 min×3次；加入Hoechst染液避光孵育10 min，洗滌液洗5 min×3次，最后加熒光抗猝滅劑封片，于熒光顯微鏡下觀察。采用ImageJ手工計數(shù)增殖細胞(綠色細胞核)占總細胞數(shù)目(藍色DAPI核總數(shù))的比例。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，hiPSC-CMs與hiPSCs RT-qPCR結(jié)果(TNNI3、MYH6、MYH7)比較采用t檢驗；三組間Western blotting檢測結(jié)果、細胞面積、圓度指數(shù)、肌節(jié)長度、細胞增殖結(jié)果比較采用單因素方差分析，進一步多重比較采用Dunnett-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 hiPSCs的鑒定 光鏡下hiPSCs集落細胞排列致密，邊緣整齊光滑，細胞正常增殖(圖2A)。免疫熒光染色結(jié)果顯示，干細胞多能性標志物Nanog、Sox2在hiPSCs中呈陽性表達(圖2B)。

圖2 hiPSCs集落觀察和多能性鑒定Fig.2 Observation and pluripotency identification of hiPSCs

2.2 hiPSC-CMs的鑒定 光鏡下可見重新接種前hiPSC-CMs成片跳動，重新接種后約24 h部分細胞恢復(fù)跳動。誘導(dǎo)后的hiPSC-CMs細胞呈團聚集，有黏液感(圖3A)。RT-qPCR結(jié)果顯示，與hiPSCs比較，hiPSC-CMs心肌相關(guān)基因TNNI3、M Y H 6、M Y H 7 的表達(分別為3.6 1±0.2 1、10 442.64±506.69、352 961.7±37 918.04)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01，圖3B)。免疫熒光染色結(jié)果顯示，hiPSC-CMs表達心肌相關(guān)標志物cTnT、Cx43、α-actinin(圖3C)。

2.3 OA對線粒體的影響 Mito-Tracker染色結(jié)果顯示，與空白對照組、DMSO組比較，OA加藥組線粒體連接成網(wǎng)絡(luò)狀(圖4A)。電鏡觀察結(jié)果顯示，與空白對照組、DMSO組比較，OA加藥組線粒體嵴更豐富且有融合趨勢，線粒體體積增大(圖4B)。Western blotting檢測結(jié)果顯示，與空白對照組、DMSO組比較，OA加藥組PKM1/PKM2比值(分別為1.00±0.00、0.97±0.08、1.36±0.13)及MFN2的表達(分別為1.00±0.00、1.21±0.25、2.02±0.004)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖4C)。

2.4 OA對細胞結(jié)構(gòu)的影響 免疫熒光染色結(jié)果顯示，經(jīng)α-actinin染色，各組均可見細胞輪廓及肌節(jié)，與空白對照組、DMSO組比較，OA加藥組細胞面積[分別為(3053.62±570.19) μm3、(4276.04±234.05) μm3、(5679.70±733.26) μm3]、肌節(jié)長度[分別為(1.62±0.06) μm、(1.58±0.09) μm、(1.93±0.10) μm]明顯增加，圓度指數(shù)(分別為0.84±0.06、0.88±0.08、0.76±0.08)明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖5)。

圖3 hiPSC-CMs形態(tài)觀察及鑒定Fig.3 Observation and identification of hiPSC-CMs

圖4 hiPSC-CMs PK和線粒體相關(guān)檢測Fig.4 Detection of PK and mitochondria in hiPSC-CMs

2.5 OA對細胞周期的影響 EDU檢測結(jié)果顯示，與空白對照組、DMSO組比較，OA加藥組增殖細胞率明顯降低(P＜0.001，圖6A、B)。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，OA加藥組≥4N的細胞數(shù)較空白對照組及DMSO組明顯增多(圖6C、D)。

3 討 論

心血管疾病造成的心肌細胞損傷無法修復(fù)及再生，而心肌代償性肥大及炎性細胞浸潤形成不良重塑，后期可導(dǎo)致心力衰竭。干細胞療法可提供整合到宿主心臟的細胞，從而減輕不良重塑。hiPSCs作為治療心血管疾病的替代細胞來源，在心臟再生中的潛力巨大，而探尋促進hiPSC-CMs成熟的方法對其臨床應(yīng)用意義重大。

本研究加入OA后觀察到了與文獻[14]一致的PK同工型轉(zhuǎn)換。AS在胚胎發(fā)育后期及出生早期心臟中普遍存在，是驅(qū)動小鼠心臟發(fā)育過程的決定性變化[5]。PKM1及PKM2是由同一基因產(chǎn)生的，分別包含第9、10外顯子[17]，單外顯子的差異賦予這兩個同工型不同的結(jié)構(gòu)和功能。PKM2主要在胚胎和增殖細胞中表達，而PKM1主要在終末分化的組織中表達[8]。高比例的PKM2/PKM1可抑制氧化磷酸化，促進糖酵解[18]。在神經(jīng)細胞中，己糖激酶及乳酸脫氫酶受到抑制，PKM2可向PKM1轉(zhuǎn)變，從而代謝，使細胞從有氧糖酵解轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸姿峄痆8]。

圖5 各組hiPSC-CMs α-actinin免疫熒光染色及細胞面積、圓度指數(shù)、肌節(jié)長度比較Fig.5 Immunofluorescence staining of α-actinin in hiPSC-CMs and cell area, sarcomere length and cell circularity index

圖6 hiPSC-CMs的增殖情況及細胞周期檢測Fig.6 Cell proliferation and cell cycle of hiPSC-CMs

心臟是人體中代謝最活躍的器官之一，但心肌細胞內(nèi)并無高濃度的ATP，而是通過線粒體快速合成ATP。在成人心肌細胞中，線粒體占細胞體積的20%以上，持續(xù)不斷地進行氧化磷酸化以滿足高能量需求[19]。在發(fā)育過程中，心肌細胞的分化和成熟伴隨著代謝方式的轉(zhuǎn)變，線粒體的狀態(tài)影響著整個過程。線粒體的融合與分裂是一個連續(xù)交替的過程，線粒體結(jié)構(gòu)不斷改變以適應(yīng)細胞發(fā)育及周圍環(huán)境的變化。線粒體融合，即小而呈點狀的線粒體融合在一起，重新形成細長且相互連接的線粒體[20]。在hiPSCs分化過程中，線粒體由點狀變?yōu)榫€狀，而在成熟的心肌中形成更為規(guī)則有序的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，小線粒體融合形成較大的線粒體，融合的線粒體網(wǎng)絡(luò)有助于為心肌細胞提供更多的能量。本研究發(fā)現(xiàn)，加入OA后線粒體融合增加。有研究發(fā)現(xiàn)，PKM2可與MFN2結(jié)合而促進線粒體融合[21]，而本研究中雖然PKM1/PKM2的比值有所升高，但其蛋白表達絕對值并未降低。在加入OA促進細胞成熟的過程中，未完全沉默PKM2可能是這一階段促進線粒體融合的原因。

在心臟的發(fā)育過程中，心肌細胞會經(jīng)歷一系列復(fù)雜的結(jié)構(gòu)變化，最終形成成年表型。大多數(shù)哺乳動物出生后不久心肌細胞即失去增殖能力[22]，不再依靠細胞數(shù)目增長實現(xiàn)生長，而肥大性生長則占據(jù)主導(dǎo)地位，人類心肌細胞可增大10～20倍[23]，在此過程中往往伴隨著心肌細胞從單核到雙核的轉(zhuǎn)變[24]，最終實現(xiàn)心肌細胞的終末分化。細胞體積增大的同時細胞形態(tài)也發(fā)生變化，從圓形變?yōu)榘魻?，細胞類圓度減小。此類細胞形態(tài)的改變與心肌細胞的功能改變息息相關(guān)，增大的細胞表面積與膜電容的增加呈正比，同時影響著脈沖傳播及收縮力[25]，而棒狀結(jié)構(gòu)則可促進興奮-收縮耦聯(lián)[26]。除了細胞形態(tài)，支撐細胞的細胞骨架也在成熟過程中發(fā)生了改變。在心肌細胞成熟過程中，肌球蛋白、肌鈣蛋白發(fā)生了胎兒同工型到成年同工型的轉(zhuǎn)變[27]，肌節(jié)變得更為整齊有條理，肌小節(jié)長度增加，最終促進收縮力的產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，經(jīng)過OA處理的hiPSC-CMs形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生了與正常心肌成熟過程一致的變化，表明OA可從形態(tài)結(jié)構(gòu)方面促進hiPSC-CMs的成熟。

除了結(jié)構(gòu)方面，心肌細胞的成熟還包括代謝方面的改變。在心臟發(fā)育早期，主要由糖酵解提供細胞所需能源，隨著心肌細胞的成熟及終末分化，代謝方式逐漸從糖酵解轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸姿峄?。代謝過程由糖酵解向氧化磷酸化的轉(zhuǎn)變與線粒體結(jié)構(gòu)的變化同時發(fā)生，為心肌細胞搏動提供充足的能量[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，加入OA后線粒體結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，而線粒體結(jié)構(gòu)的改變往往伴隨著代謝改變，從而實現(xiàn)代謝層面上的心肌細胞成熟，但其機制仍有待進一步研究。

近年來，對植物生物活性成分的研究不斷增多，且從植物中提取的有效成分在抗腫瘤[28]、保肝[29]、抗心血管疾病[30]等方面的作用已得到證實，其中三萜類化合物已用于治療各種疾病[31]。五環(huán)三萜類化合物OA存在于多種植物中，最初作為保肝藥物應(yīng)用，但是隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)它在多種疾病的治療中具有一定作用。OA在多種細胞生命歷程中發(fā)揮了重要作用[15-16]，本研究也發(fā)現(xiàn)，加入OA可促進hiPSC-CMs的成熟?？傊捎肙A促進hiPSCCMs的成熟可為hiPSC-CMs的研究提供一種新的思路，為促進hiPSC-CMs未來的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。