益氣補(bǔ)腎調(diào)脂方對(duì)非酒精性脂肪性肝炎小鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因mRNA的影響*

吳黎艷 陸增生 何蓓暉 陳永燦 陳芝蕓#

1 浙江省立同德醫(yī)院 浙江 杭州 300012

2 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 浙江 杭州 310006

非酒精性脂肪肝?。∟AFLD）具有廣泛的疾病譜，其中包括單純性非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝纖維化、肝硬化，甚至疾病終末期的肝細(xì)胞肝癌[1]。近年的研究顯示，高脂飲食、肥胖等因素引發(fā)的脂質(zhì)代謝紊亂所產(chǎn)生的脂毒性，導(dǎo)致肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在NASH的發(fā)生進(jìn)展中扮演著重要作用。本研究從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激角度來研究益氣補(bǔ)腎調(diào)脂方改善高脂高果糖飲食誘導(dǎo)的NASH小鼠的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：30只C57BL/6小鼠，雄性，SPF級(jí)，體重約20±2克，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016；飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 益氣補(bǔ)腎調(diào)脂方浸潤(rùn)膏的制備：黃芪、炒白術(shù)、茯苓、制首烏、淫羊藿、郁金、生山楂、海藻、桃仁，中藥復(fù)方按10∶4∶5∶3∶4∶3∶8∶3∶3比例組成，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥制劑室制成流浸膏。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑：ABI7900PCR儀（美國(guó)ABI公司），OSE-Y10電動(dòng)研磨器（TIANGEN公司），JA1003N型天平（梅托勒-托利多儀器有限公司），恒溫孵育搖床（美國(guó)Eppendorf公司），游離脂肪酸（FFAs）試劑盒（ELISA）由abcam公司提供（批號(hào)：ab65342），基因引物由上海生工生物技術(shù)（Sangon Biotech）公司設(shè)計(jì)，并由上海生工生物技術(shù)（Sangon Biotech）公司合成，見表1。

表1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因mRNA的引物序列

1.4 實(shí)驗(yàn)方法：30只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為5組，正常組、模型組、益氣補(bǔ)腎調(diào)脂方高劑量組、益氣補(bǔ)腎調(diào)脂方中劑量組、益氣補(bǔ)腎調(diào)脂方低劑量組，每組各6只。正常組予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)以及自由飲水，其他各組予高脂飼料喂養(yǎng)以及自由飲用20%果糖水，在造模第5周開始，益氣補(bǔ)腎調(diào)脂方高、中、低劑量組分別灌服53.52g/（kg·d）、26.76g/（kg·d）、13.38g/（kg·d）益氣補(bǔ)腎調(diào)脂方流浸膏，連續(xù)給藥12周，正常組和模型組灌服等容量蒸餾水；16周末處死所有小鼠；腹腔麻醉下取血和收集肝臟標(biāo)本，ELISA法檢測(cè)血清游離脂肪酸(FFAs)水平；real time-PCR法檢測(cè)相關(guān)基因mRNA，以β-actin為內(nèi)參照基因,計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量(2-△△Ct)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：所有數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析，多組間比較用LSD分析(方差齊性時(shí))或Dunnett’s T3(方差不齊性時(shí))。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 益氣補(bǔ)腎調(diào)脂方對(duì)NASH小鼠血清FFAs的影響：高脂高果糖飲食喂養(yǎng)16周時(shí)，模型組和各中藥復(fù)方組的血清FFAs水平較正常組具有不同程度的升高（P＜0.05，P＜0.01）。經(jīng)不同劑量的益氣補(bǔ)腎調(diào)脂方干預(yù)后，小鼠血清FFAs水平較模型組具有不同程度的下降。見圖1。

圖1 益氣補(bǔ)腎調(diào)脂方對(duì)NASH小鼠血清FFAs的影響(n=6)

2.2 益氣補(bǔ)腎調(diào)脂方對(duì)NASH小鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因mRNA的影響：經(jīng)過16周高脂高果糖飲食后，模型組肝組織葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）、激活轉(zhuǎn)錄因子6（ATF6）、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）mRNA的表達(dá)水平較正常組明顯升高，經(jīng)過不同劑量的益氣補(bǔ)腎調(diào)脂方干預(yù)后，肝組織GRP78、ATF6、CHOPmRNA的表達(dá)水平較模型組均有不同程度的下降（P＜0.05）。模型組肝組織XBP1mRNA的表達(dá)水平較正常組下降（P＜0.05），經(jīng)過不同劑量的中藥復(fù)方干預(yù)后，各治療組的肝組織X-盒結(jié)合蛋白1（XBP1）mRNA較模型組均有所上升（P＜0.05）。見圖2。

圖2 益氣補(bǔ)腎調(diào)脂方對(duì)NASH小鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)mRNA的影響(n=6)

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）在NASH的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用[2-4]。高脂或高脂高糖等情況下，機(jī)體內(nèi)大量的FFAs等產(chǎn)生的脂毒性所引發(fā)的ERS，會(huì)激發(fā)一系列的促凋亡通路，進(jìn)而導(dǎo)致肝細(xì)胞的損傷、凋亡[5]。GRP78是ERS的標(biāo)志物[6]。ERS介導(dǎo)ATF6/CHOP信號(hào)通路的激活，并抑制XBP1的表達(dá)[7]，參與NASH的發(fā)生進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)高脂高果糖飲食誘導(dǎo)的NASH小鼠，血清中FFAs明顯升高，ERS的標(biāo)志物GRP78mRNA的表達(dá)明顯升高，同時(shí)，ATF6、CHOPmRNA的表達(dá)也增強(qiáng)，XBP1mRNA的表達(dá)受到抑制。提示血清FFAs升高等產(chǎn)生的脂毒性所引發(fā)的ERS，激發(fā)ATF6/CHOP信號(hào)通路，促使NASH的發(fā)生進(jìn)展。

NASH可歸屬于中醫(yī)學(xué)中“肝著”“積聚”“痞滿”等范圍。其發(fā)病多由于肝、脾、腎功能失調(diào)，濕、痰、瘀互結(jié)而致。益氣補(bǔ)腎調(diào)脂方中炙黃芪補(bǔ)脾肺之氣，炒白術(shù)健脾助運(yùn)，茯苓健脾利水滲濕；制首烏、淫羊藿補(bǔ)肝腎、益精血；海藻消痰軟堅(jiān)散結(jié)，生山楂祛瘀消積，桃仁破血逐瘀，郁金行氣解郁、活血化瘀，以助痰瘀消除。諸藥合用，使?jié)?、痰、瘀、積得消，共達(dá)益氣健脾、補(bǔ)腎益肝、化痰祛瘀之功。前期研究顯示，益氣補(bǔ)腎調(diào)脂方能夠明顯改善NASH小鼠肝臟病理組織學(xué)變化，提高機(jī)體的抗氧化能力[8]。本研究顯示，高脂高果糖飲食誘導(dǎo)的NASH小鼠，經(jīng)益氣補(bǔ)腎調(diào)脂肪干預(yù)后，能夠明顯下降肝組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物GRP78mRNA的表達(dá)，下降A(chǔ)TF6、CHOPmRNA的表達(dá)，并能在一定程度上提升XBP1mRNA的表達(dá)。因此，益氣補(bǔ)腎調(diào)脂方治療NASH的作用機(jī)制可能與改善肝臟的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。