饒斌 查昀 鐘蕾 姚益群
(1.黃石市第五醫(yī)院,湖北 黃石 420204;2.黃石市中心醫(yī)院, 湖北 黃石 435000)
腦出血是臨床上常見的腦卒中亞型,是指非外傷性腦實質(zhì)內(nèi)血管破裂引起的出血[1]。全世界范圍內(nèi)每年腦出血發(fā)病人數(shù)約為兩百萬,且具有較高的病死率,而存活的患者也常常遺留有嚴重的神經(jīng)功能障礙,容易對患者的身體及心理造成不良影響,也給患者及其家屬帶來沉重的經(jīng)濟負擔[2]。現(xiàn)在臨床上多采用西藥或手術方式對腦出血患者進行治療,但是這兩種方法都療效欠佳,因此,找到一種有效可行的治療方案迫在眉睫[3]。近年來,中藥治療腦出血在臨床上取得了一定的成果,中醫(yī)認為腦出血的病理基礎是淤血,因此治療腦出血的關鍵在于活血化瘀[4]。苗藥血脈通是苗族醫(yī)藥根據(jù)活血化瘀相關理論自擬組方成藥,具有化瘀的作用,常用于治療因淤血閉阻引起的胸痹、癥見胸悶、胸痛、心悸及冠心病心絞痛等疾病,且取得了很好的臨床治療效果[5-6]。然而,人們對于其在腦出血中的應用研究較少,因此,本研究采用苗藥血脈通治療腦出血模型大鼠,基于血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)信號通路探究苗藥血脈通對大鼠腦出血模型腦組織細胞自噬、凋亡的作用,為臨床治療腦出血提供新的思路。
1.1 實驗動物 正常Wistar雄性清潔級大鼠50只,體重在240~260 g之間,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供,動物許可證號SCXK(京)2017-0022。隨機選取12只作為假手術組,剩余大鼠用于腦出血造模。
1.2 實驗試劑及儀器 血脈通膠囊(貴州益康制藥有限公司),其成分有丹參、澤瀉、葛根、野鴨椿、川穹、赤芍、桂枝等;PIK3、AKT、SCDF-1α、CXCR兔抗大鼠多克隆免疫組化檢測試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司);ELISA檢測試劑盒(美國賽默飛公司);Beclin-1、VEGF、SCDF-1α、CXCR-4一抗(美國艾美捷科技有限公司);光學顯微鏡(上光中恒公司);倒置熒光顯微鏡(日本尼康公司);離心機(江蘇賽德力制藥機械制造有限公司);電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。
1.3 造模方式
1.3.1 腦出血大鼠模型制備 采用Rosenberg法制備腦出血模型[7]。以10%水合氯醛(400 mg/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉大鼠,將大鼠固定在立體儀上,于頭部正中間進行縱橫切口,隨后將大鼠骨膜剝離,使其冠狀縫和前囟裸露。在大鼠前囟之前約1.0 mm、中線右側約3.0 mm處鉆一個直徑約為1.0 mm的小孔。采用微量注射器從股動脈抽取適量的血液,借助立體定向儀沿鉆孔垂直進針6.0 mm左右,緩慢注血80 μL,將針留置10 min后撤針,采用消毒針縫合切口。模型組、治療組均造模,假手術組僅僅裸露頸總動脈、神經(jīng)。
1.3.2 腦出血大鼠模型造模成功檢驗標準 以造模大鼠清醒后出現(xiàn)同側Horner征作為腦出血大鼠模型制備成功,即出現(xiàn)沒有方向性的自主運動、提尾時向右側旋轉(zhuǎn)、會自行向右轉(zhuǎn)圈、右前肢發(fā)生癱瘓或者右前肢內(nèi)收、腕屈曲,曲頭朝向右側背部。本研究中造模成功大鼠只數(shù)為36只。
1.4 藥物干預 將造模成功的大鼠隨機分為3組,分別為腦出血組、給藥A組和給藥B組,每組12只。其中6只用于測定出血病灶體積,6只用于測定各蛋白陽性表達及細胞凋亡情況。大鼠的給藥方式為灌胃,從造模后第二天開始,給藥組A組和B組大鼠均連續(xù)給藥35 d,給藥量分別為15 mg/(kg·d)、30 mg/(kg·d),假手術組及腦出血組大鼠均在相同時間予以等量的生理鹽水。
1.5 觀察指標
1.5.1 細胞凋亡變化 各組大鼠在給藥35 d后,于最后給藥的4 h后,采用乙醚將大鼠麻醉后斷頭處理,選取視交叉至漏斗部之間的腦組織,將其置于10%CH3CHO中于4 ℃冰箱固定48 h,隨后進行石蠟包埋,采用組織切片機制備5 μm厚度的冠狀切片,經(jīng)常規(guī)脫蠟、乙醇脫水。采用TUNEL法利用檢測試劑盒按照說明書進行細胞凋亡檢測,利用熒光顯微鏡觀察細胞凋亡的變化,凋亡細胞以細胞核呈棕黃色著色為陽性細胞,在高倍鏡下選取5個區(qū)域,各計數(shù)100 mm3范圍內(nèi)陽性細胞數(shù),取5個區(qū)域平均值作為各組大鼠腦組織陽性細胞數(shù)。
1.5.2 出血病灶體積測定 選取視交叉至漏斗部之間的腦組織,多聚甲醛固定,在灌狀面連續(xù)切片(厚度為20 μm),測量出血區(qū)最大切面的長和寬,采用如下公式計算各組大鼠血腫體積??偛≡铙w積=1/2×A×B×C(其中A代表血腫長徑,B表血腫寬徑,C代表血腫層數(shù))。
1.5.3 Western blot法檢測Beclin-1、VEGF、SCDF-1α、CXCR-4蛋白表達 提取總蛋白,采用BCA檢測試劑盒,SDS-PAGE凝膠電泳,電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,于水平搖床室溫封閉1 h,4 ℃一抗孵育過夜,室溫二抗孵育2 h,ECL系統(tǒng)顯色。運用凝膠成像分析系統(tǒng)測量各陽性條帶的吸光度,以β-actin為內(nèi)參照,將吸光度的比值作為蛋白的相對表達量。
1.5.4 免疫組化檢測PI3K、AKT蛋白表達 常規(guī)對腦組織石蠟切片脫蠟后用3%過氧化氫蒸餾水洗3次并進行熱修復抗原。首先,滴加正常血清封閉液37 ℃ 20 min;第二次,滴加稀釋的一抗,37 ℃ 60 min后4 ℃過夜,PBS洗滌;第三次,滴加生物素化山羊抗兔IgG 37 ℃ 20 min后采用PBS洗滌后用DAB顯色、脫色、透片、封片。采用HPIAS-1000高清晰彩色病例圖片分析系統(tǒng)進行圖像分析。PI3K、AKT陽性細胞數(shù)的定量分析采用顯微鏡計數(shù)法,隨機選取5個高倍鏡視野,統(tǒng)計其陽性細胞數(shù),取其平均值作為計數(shù)結果。
2.1 各組細胞凋亡變化比較 治療后,腦出血組、給藥A組及給藥B組大鼠腦組織陽性細胞數(shù)均明顯多于假手術組(P<0.05);給藥A組陽性細胞數(shù)為(93.76±12.73)個,給藥B組陽性細胞數(shù)為(79.65±9.97)個,均顯著低于腦出血組的(124.75±11.33)個,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖1。
圖1 治療后各組大鼠腦組織陽性細胞數(shù)
2.2 各組腦出血病灶體積測定比較 假手術組大鼠腦組織未出現(xiàn)腦出血病灶,給藥A組腦出血病灶體積為(35.06±6.03)mm3,給藥B組腦出血病灶體積為(8.36±3.65)mm3,均顯著低于腦出血組的(55.51±7.31)mm3,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖2。
圖2 各組大鼠腦出血病灶體積變化
2.3 各組大鼠Beclin-1、VEGF蛋白表達量比較 腦出血組Beclin-1、VEGF蛋白表達量均明顯高于假手術組(P<0.05);給藥A組及B組Beclin-1、VEGF蛋白表達量均高于腦出血組(P<0.05),見圖3。
圖3 各組大鼠Beclin-1、VEGF蛋白表達量
2.4 各組免疫組化檢測PI3K、AKT蛋白表達水平比較 腦出血組大鼠PI3K、AKT蛋白陽性表達吸光度均高于假手術組(P<0.05);給藥A組及B組大鼠PI3K、AKT蛋白陽性表達吸光度均高于腦出血組(P<0.05),見圖4、圖5。
圖4 各組大鼠PI3K蛋白陽性表達吸光度(200×)
圖5 各組大鼠AKT蛋白陽性表達吸光度(200×)
2.5 各組大鼠CXCR-4、SCDF-1α蛋白表達比較 腦出血組大鼠CXCR-4、SCDF-1α蛋白表達量均高于假手術組(P<0.05);給藥A組及B組大鼠CXCR-4、SCDF-1α蛋白表達量均高于腦出血組(P<0.05),見圖6。
中醫(yī)認為腦出血的病理基礎是淤血,治療腦出血的關鍵在于活血化瘀[8]。臨床上,苗藥血脈通常用于治療因淤血閉阻引起的各類疾病,包括胸痹、癥見胸悶、心悸及冠心病心絞痛等疾病,被證實具有較好的活血化瘀作用。在本研究中,予以腦出血模型大鼠苗藥血脈通治療后,其腦組織細胞凋亡數(shù)及大鼠腦出血病灶體積均顯著低于腦出血組,提示苗藥血脈通用于治療腦出血具有很好的療效。VEGF是促血管生成因子,能與細胞內(nèi)皮細胞膜上的相應受體結合進而引發(fā)下游信號級聯(lián),促進血管新生[9]。而大量研究表明腦出血的發(fā)生和發(fā)展與VEGF及其相應信號通路密切相關[10]。
圖6 各組大鼠CXCR-4、SCDF-α蛋白表達量
自噬是真核細胞降解和再循環(huán)胞質(zhì)內(nèi)容物的主要途徑,在維護細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面起到很重要的作用[11-12]。Beclin-1作為酵母Atg6/ps30基因的同源物之一,能作為檢測自噬活動的標記蛋白[13]。與自噬密切相關的Beclin-1蛋白及SCDF-α/CXCR4通路都在腦出血中發(fā)揮著重要的生物效應,兩者的交點重要信號通路為PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路。在發(fā)生腦出血后,機體自身能夠釋放出一些能將具有酪氨酸激酶活性受體激活的物質(zhì),其能與PI3K的調(diào)節(jié)亞基特異性結合,激活PI3K。AKT作為PI3K下游的效應分子,能與PI3K結合,從而使AKT從細胞質(zhì)向細胞膜轉(zhuǎn)位,并改變其構象,使AKT的Thr308及Ser473位點發(fā)生磷酸化,將AKT由抑制狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ顮顟B(tài)[14]。AKT活化后即成為p-AKT,p-AKT表達量可用于衡量PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路的活化程度,通過參與PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路促進細胞增殖和阻止細胞凋亡的發(fā)生[15]。
SCDF-α/CXCR4信號軸是指趨化因子SCDF-α結合其特異性受體CXCR4的N端,隨后通過多種方式實現(xiàn)PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路的激活,從而影響細胞的生長、趨化及血管生成等生物效應[16]。SCDF-α/CXCR4信號軸在腦出血損傷中,不僅能調(diào)控內(nèi)源性細胞遷移,促進新生血管的形成,通過增強機體抗氧化能力抑制細胞凋亡,實現(xiàn)腦保護作用,還能調(diào)控細胞自噬作用,從而實現(xiàn)對細胞凋亡的調(diào)控[17]。當機體內(nèi)CXCR4表達下調(diào)時,作為自噬啟動因子的PI3KmRNA及其相應蛋白PI3K表達也下調(diào)。也就是說,CXCR4/PI3K自噬軸信號傳導通路不僅能激發(fā)細胞自噬,還能調(diào)控細胞自噬狀態(tài)[18]。
在腦血管內(nèi)皮細胞中,PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路是直接調(diào)節(jié)VEGF基因表達的重要信號通路之一。相關研究表明,抑制PI3K/AKT的活性,能有效抑制VEGF的表達,證實VEGF表達確實由PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路所調(diào)控[19]。苗藥血脈通主要成分為丹參、澤瀉、葛根、野鴨椿、川穹、赤芍、桂枝等,具有增強微血管抗損傷的功效及出色的神經(jīng)保護功能。腦出血大鼠經(jīng)苗藥血脈通治療后,相比較于腦出血組,給藥組大鼠細胞凋亡數(shù)、腦出血病灶體積顯著降低,Beclin-1、VEGF、PI3K、AKT、SCDF-α、CXCR-4等蛋白表達量顯著升高,提示苗藥血脈通能夠通過影響腦出血大鼠腦組織自噬狀態(tài)來調(diào)節(jié)大鼠神經(jīng)功能,其可能的機制為予以大鼠苗藥血脈通后能夠激活腦出血大鼠VEGF信號通路,增加VEGF蛋白表達量,進而激活大鼠體內(nèi)PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路,PI3K磷酸化后導致PI3K減少,從而使得與PI3K形成復合物的Beclin-1表達量相應減少,因而有效提升細胞自噬能力,隨后CXCR4與磷酸化的PI3K結合形成CXCR4/PI3K自噬軸,影響自噬活動,抑制細胞凋亡。
苗藥血脈通能夠激活腦出血大鼠VEGF信號通路,既能激發(fā)細胞自噬,又能夠調(diào)控細胞自噬狀態(tài),實現(xiàn)抑制細胞凋亡的腦保護作用,為臨床治療腦出血提供了新的思路。