基于VEGF信號通路研究苗藥血脈通對腦出血大鼠腦組織細(xì)胞自噬與凋亡的作用*

饒斌 查昀 鐘蕾 姚益群

(1.黃石市第五醫(yī)院，湖北 黃石 420204；2.黃石市中心醫(yī)院， 湖北 黃石 435000)

腦出血是臨床上常見的腦卒中亞型，是指非外傷性腦實質(zhì)內(nèi)血管破裂引起的出血[1]。全世界范圍內(nèi)每年腦出血發(fā)病人數(shù)約為兩百萬，且具有較高的病死率，而存活的患者也常常遺留有嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙，容易對患者的身體及心理造成不良影響，也給患者及其家屬帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。現(xiàn)在臨床上多采用西藥或手術(shù)方式對腦出血患者進(jìn)行治療，但是這兩種方法都療效欠佳，因此，找到一種有效可行的治療方案迫在眉睫[3]。近年來，中藥治療腦出血在臨床上取得了一定的成果，中醫(yī)認(rèn)為腦出血的病理基礎(chǔ)是淤血，因此治療腦出血的關(guān)鍵在于活血化瘀[4]。苗藥血脈通是苗族醫(yī)藥根據(jù)活血化瘀相關(guān)理論自擬組方成藥，具有化瘀的作用，常用于治療因淤血閉阻引起的胸痹、癥見胸悶、胸痛、心悸及冠心病心絞痛等疾病，且取得了很好的臨床治療效果[5-6]。然而，人們對于其在腦出血中的應(yīng)用研究較少，因此，本研究采用苗藥血脈通治療腦出血模型大鼠，基于血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)信號通路探究苗藥血脈通對大鼠腦出血模型腦組織細(xì)胞自噬、凋亡的作用，為臨床治療腦出血提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 正常Wistar雄性清潔級大鼠50只，體重在240～260 g之間，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號SCXK(京)2017-0022。隨機(jī)選取12只作為假手術(shù)組，剩余大鼠用于腦出血造模。

1.2 實驗試劑及儀器 血脈通膠囊(貴州益康制藥有限公司)，其成分有丹參、澤瀉、葛根、野鴨椿、川穹、赤芍、桂枝等；PIK3、AKT、SCDF-1α、CXCR兔抗大鼠多克隆免疫組化檢測試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司)；ELISA檢測試劑盒(美國賽默飛公司)；Beclin-1、VEGF、SCDF-1α、CXCR-4一抗(美國艾美捷科技有限公司)；光學(xué)顯微鏡(上光中恒公司)；倒置熒光顯微鏡(日本尼康公司)；離心機(jī)(江蘇賽德力制藥機(jī)械制造有限公司)；電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.3 造模方式

1.3.1 腦出血大鼠模型制備 采用Rosenberg法制備腦出血模型[7]。以10%水合氯醛(400 mg/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠固定在立體儀上，于頭部正中間進(jìn)行縱橫切口，隨后將大鼠骨膜剝離，使其冠狀縫和前囟裸露。在大鼠前囟之前約1.0 mm、中線右側(cè)約3.0 mm處鉆一個直徑約為1.0 mm的小孔。采用微量注射器從股動脈抽取適量的血液，借助立體定向儀沿鉆孔垂直進(jìn)針6.0 mm左右，緩慢注血80 μL，將針留置10 min后撤針，采用消毒針縫合切口。模型組、治療組均造模，假手術(shù)組僅僅裸露頸總動脈、神經(jīng)。

1.3.2 腦出血大鼠模型造模成功檢驗標(biāo)準(zhǔn) 以造模大鼠清醒后出現(xiàn)同側(cè)Horner征作為腦出血大鼠模型制備成功，即出現(xiàn)沒有方向性的自主運動、提尾時向右側(cè)旋轉(zhuǎn)、會自行向右轉(zhuǎn)圈、右前肢發(fā)生癱瘓或者右前肢內(nèi)收、腕屈曲，曲頭朝向右側(cè)背部。本研究中造模成功大鼠只數(shù)為36只。

1.4 藥物干預(yù) 將造模成功的大鼠隨機(jī)分為3組，分別為腦出血組、給藥A組和給藥B組，每組12只。其中6只用于測定出血病灶體積，6只用于測定各蛋白陽性表達(dá)及細(xì)胞凋亡情況。大鼠的給藥方式為灌胃，從造模后第二天開始，給藥組A組和B組大鼠均連續(xù)給藥35 d，給藥量分別為15 mg/(kg·d)、30 mg/(kg·d)，假手術(shù)組及腦出血組大鼠均在相同時間予以等量的生理鹽水。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 細(xì)胞凋亡變化 各組大鼠在給藥35 d后，于最后給藥的4 h后，采用乙醚將大鼠麻醉后斷頭處理，選取視交叉至漏斗部之間的腦組織，將其置于10%CH3CHO中于4 ℃冰箱固定48 h，隨后進(jìn)行石蠟包埋，采用組織切片機(jī)制備5 μm厚度的冠狀切片，經(jīng)常規(guī)脫蠟、乙醇脫水。采用TUNEL法利用檢測試劑盒按照說明書進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測，利用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡的變化，凋亡細(xì)胞以細(xì)胞核呈棕黃色著色為陽性細(xì)胞，在高倍鏡下選取5個區(qū)域，各計數(shù)100 mm3范圍內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)，取5個區(qū)域平均值作為各組大鼠腦組織陽性細(xì)胞數(shù)。

1.5.2 出血病灶體積測定 選取視交叉至漏斗部之間的腦組織，多聚甲醛固定，在灌狀面連續(xù)切片(厚度為20 μm)，測量出血區(qū)最大切面的長和寬，采用如下公式計算各組大鼠血腫體積?？偛≡铙w積=1/2×A×B×C(其中A代表血腫長徑，B表血腫寬徑，C代表血腫層數(shù))。

1.5.3 Western blot法檢測Beclin-1、VEGF、SCDF-1α、CXCR-4蛋白表達(dá) 提取總蛋白，采用BCA檢測試劑盒，SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，于水平搖床室溫封閉1 h，4 ℃一抗孵育過夜，室溫二抗孵育2 h，ECL系統(tǒng)顯色。運用凝膠成像分析系統(tǒng)測量各陽性條帶的吸光度，以β-actin為內(nèi)參照，將吸光度的比值作為蛋白的相對表達(dá)量。

1.5.4 免疫組化檢測PI3K、AKT蛋白表達(dá) 常規(guī)對腦組織石蠟切片脫蠟后用3%過氧化氫蒸餾水洗3次并進(jìn)行熱修復(fù)抗原。首先，滴加正常血清封閉液37 ℃ 20 min；第二次，滴加稀釋的一抗，37 ℃ 60 min后4 ℃過夜，PBS洗滌；第三次，滴加生物素化山羊抗兔IgG 37 ℃ 20 min后采用PBS洗滌后用DAB顯色、脫色、透片、封片。采用HPIAS-1000高清晰彩色病例圖片分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。PI3K、AKT陽性細(xì)胞數(shù)的定量分析采用顯微鏡計數(shù)法，隨機(jī)選取5個高倍鏡視野，統(tǒng)計其陽性細(xì)胞數(shù)，取其平均值作為計數(shù)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞凋亡變化比較 治療后，腦出血組、給藥A組及給藥B組大鼠腦組織陽性細(xì)胞數(shù)均明顯多于假手術(shù)組(P<0.05)；給藥A組陽性細(xì)胞數(shù)為(93.76±12.73)個，給藥B組陽性細(xì)胞數(shù)為(79.65±9.97)個，均顯著低于腦出血組的(124.75±11.33)個，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 治療后各組大鼠腦組織陽性細(xì)胞數(shù)

2.2 各組腦出血病灶體積測定比較 假手術(shù)組大鼠腦組織未出現(xiàn)腦出血病灶，給藥A組腦出血病灶體積為(35.06±6.03)mm3，給藥B組腦出血病灶體積為(8.36±3.65)mm3，均顯著低于腦出血組的(55.51±7.31)mm3，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 各組大鼠腦出血病灶體積變化

2.3 各組大鼠Beclin-1、VEGF蛋白表達(dá)量比較 腦出血組Beclin-1、VEGF蛋白表達(dá)量均明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)；給藥A組及B組Beclin-1、VEGF蛋白表達(dá)量均高于腦出血組(P<0.05)，見圖3。

圖3 各組大鼠Beclin-1、VEGF蛋白表達(dá)量

2.4 各組免疫組化檢測PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平比較 腦出血組大鼠PI3K、AKT蛋白陽性表達(dá)吸光度均高于假手術(shù)組(P<0.05)；給藥A組及B組大鼠PI3K、AKT蛋白陽性表達(dá)吸光度均高于腦出血組(P<0.05)，見圖4、圖5。

圖4 各組大鼠PI3K蛋白陽性表達(dá)吸光度(200×)

圖5 各組大鼠AKT蛋白陽性表達(dá)吸光度(200×)

2.5 各組大鼠CXCR-4、SCDF-1α蛋白表達(dá)比較 腦出血組大鼠CXCR-4、SCDF-1α蛋白表達(dá)量均高于假手術(shù)組(P<0.05)；給藥A組及B組大鼠CXCR-4、SCDF-1α蛋白表達(dá)量均高于腦出血組(P<0.05)，見圖6。

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為腦出血的病理基礎(chǔ)是淤血，治療腦出血的關(guān)鍵在于活血化瘀[8]。臨床上，苗藥血脈通常用于治療因淤血閉阻引起的各類疾病，包括胸痹、癥見胸悶、心悸及冠心病心絞痛等疾病，被證實具有較好的活血化瘀作用。在本研究中，予以腦出血模型大鼠苗藥血脈通治療后，其腦組織細(xì)胞凋亡數(shù)及大鼠腦出血病灶體積均顯著低于腦出血組，提示苗藥血脈通用于治療腦出血具有很好的療效。VEGF是促血管生成因子，能與細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合進(jìn)而引發(fā)下游信號級聯(lián)，促進(jìn)血管新生[9]。而大量研究表明腦出血的發(fā)生和發(fā)展與VEGF及其相應(yīng)信號通路密切相關(guān)[10]。

圖6 各組大鼠CXCR-4、SCDF-α蛋白表達(dá)量

自噬是真核細(xì)胞降解和再循環(huán)胞質(zhì)內(nèi)容物的主要途徑，在維護(hù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面起到很重要的作用[11-12]。Beclin-1作為酵母Atg6/ps30基因的同源物之一，能作為檢測自噬活動的標(biāo)記蛋白[13]。與自噬密切相關(guān)的Beclin-1蛋白及SCDF-α/CXCR4通路都在腦出血中發(fā)揮著重要的生物效應(yīng)，兩者的交點重要信號通路為PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在發(fā)生腦出血后，機(jī)體自身能夠釋放出一些能將具有酪氨酸激酶活性受體激活的物質(zhì)，其能與PI3K的調(diào)節(jié)亞基特異性結(jié)合，激活PI3K。AKT作為PI3K下游的效應(yīng)分子，能與PI3K結(jié)合，從而使AKT從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位，并改變其構(gòu)象，使AKT的Thr308及Ser473位點發(fā)生磷酸化，將AKT由抑制狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ顮顟B(tài)[14]。AKT活化后即成為p-AKT，p-AKT表達(dá)量可用于衡量PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化程度，通過參與PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)細(xì)胞增殖和阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生[15]。

SCDF-α/CXCR4信號軸是指趨化因子SCDF-α結(jié)合其特異性受體CXCR4的N端，隨后通過多種方式實現(xiàn)PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，從而影響細(xì)胞的生長、趨化及血管生成等生物效應(yīng)[16]。SCDF-α/CXCR4信號軸在腦出血損傷中，不僅能調(diào)控內(nèi)源性細(xì)胞遷移，促進(jìn)新生血管的形成，通過增強機(jī)體抗氧化能力抑制細(xì)胞凋亡，實現(xiàn)腦保護(hù)作用，還能調(diào)控細(xì)胞自噬作用，從而實現(xiàn)對細(xì)胞凋亡的調(diào)控[17]。當(dāng)機(jī)體內(nèi)CXCR4表達(dá)下調(diào)時，作為自噬啟動因子的PI3KmRNA及其相應(yīng)蛋白PI3K表達(dá)也下調(diào)。也就是說，CXCR4/PI3K自噬軸信號傳導(dǎo)通路不僅能激發(fā)細(xì)胞自噬，還能調(diào)控細(xì)胞自噬狀態(tài)[18]。

在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中，PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是直接調(diào)節(jié)VEGF基因表達(dá)的重要信號通路之一。相關(guān)研究表明，抑制PI3K/AKT的活性，能有效抑制VEGF的表達(dá)，證實VEGF表達(dá)確實由PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路所調(diào)控[19]。苗藥血脈通主要成分為丹參、澤瀉、葛根、野鴨椿、川穹、赤芍、桂枝等，具有增強微血管抗損傷的功效及出色的神經(jīng)保護(hù)功能。腦出血大鼠經(jīng)苗藥血脈通治療后，相比較于腦出血組，給藥組大鼠細(xì)胞凋亡數(shù)、腦出血病灶體積顯著降低，Beclin-1、VEGF、PI3K、AKT、SCDF-α、CXCR-4等蛋白表達(dá)量顯著升高，提示苗藥血脈通能夠通過影響腦出血大鼠腦組織自噬狀態(tài)來調(diào)節(jié)大鼠神經(jīng)功能，其可能的機(jī)制為予以大鼠苗藥血脈通后能夠激活腦出血大鼠VEGF信號通路，增加VEGF蛋白表達(dá)量，進(jìn)而激活大鼠體內(nèi)PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，PI3K磷酸化后導(dǎo)致PI3K減少，從而使得與PI3K形成復(fù)合物的Beclin-1表達(dá)量相應(yīng)減少，因而有效提升細(xì)胞自噬能力，隨后CXCR4與磷酸化的PI3K結(jié)合形成CXCR4/PI3K自噬軸，影響自噬活動，抑制細(xì)胞凋亡。

4 結(jié)論

苗藥血脈通能夠激活腦出血大鼠VEGF信號通路，既能激發(fā)細(xì)胞自噬，又能夠調(diào)控細(xì)胞自噬狀態(tài)，實現(xiàn)抑制細(xì)胞凋亡的腦保護(hù)作用，為臨床治療腦出血提供了新的思路。