miR-301a對三陰性乳腺癌細胞侵襲與增殖的調控作用*

劉恒 王鋼樂 李秀楠

(首都醫(yī)科大學附屬北京婦產醫(yī)院乳腺科，北京 100006)

三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC)是乳腺癌的重要臨床亞型之一，是一類侵襲性、惡性程度高且復發(fā)轉移率較乳腺癌其他亞型更高的惡性腫瘤，其預后較非TNBC差[1]。目前TNBC首選的治療措施仍然是手術+化療，但患者的總體預后仍然不容樂觀，積極探索TNBC發(fā)生發(fā)展的分子機制，尋求有效的抗TNBC細胞增殖的治療措施對改善預后尤為重要。研究發(fā)現，miR-301a可作為癌基因參與結直腸癌、肝癌、胃癌、胰腺癌等惡行生物學行為。FANG等[2]提出miR-301a通過靶向SOCS6促進結直腸癌細胞的侵襲和增殖；He等[3]提出miR-301a對肝細胞癌具有潛在診斷價值。miR-301a表達上調可通過靶向RUNX3促進胃癌細胞的遷徙和增殖[4]，miR-301a過表達可增強胰腺導管癌的侵襲、遷移及成瘤能力[5]。本研究通過觀察miR-301a對TNBC細胞侵襲、增殖能力的影響，以探討miR-301a的作用機制，為TNBC的個體化治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 人正常乳腺上皮細胞MCF-10A與TNBC細胞系MDA-MB-231(中科院上海生命科學研究院細胞資源中心)。用100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素、10%胎牛血清(FBS)(美國GIBCO公司)的DMEM培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)于5% CO2、37.5 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司， miRNA qPCR 試 劑 盒購自北京艾德萊生物科技有限公司，miR-301a模擬物、miRNA 逆轉錄試劑盒、miR-301a抑制物及其陰性對照均購自北京全式金生物技術有限公司，Transwell 小室試劑盒購自Corning公司；MTT試劑盒購自北京富龍康泰生物技術有限公司；RIPA 裂解液購自美國GIBCO公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞轉染 首先將MDA-MB-231細胞均勻接種于6孔板中，密度1.2×105個/孔，培養(yǎng)至細胞融合度為 70%～80%。轉染時，應用 LipofectamineTM3000 分別將 miR-301a 模擬物(mimics)、Mimics NC、抑制劑(inhibitor)及Inhibitor NC轉染細胞，轉染終濃度為100 nmol/L，分為Mimics miR-301a組、Mimics NC組、 Inhibitor miR-301a組、Inhibitor NC組，空白組不予任何處理。用無雙抗100 mL/L 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)8 h 后換成正常培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，轉染48 h后收取細胞用于后續(xù)轉染效果檢測及相關功能實驗。

1.2.2 real-time PCR檢測 應用總RNA抽提(Trizol reagent)試劑分別提取MDA-MB-231細胞、MCF-10A細胞中的總RNA，用Nanodrop分光光度計測定所抽提RNA濃度和質量。根據反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄獲cDNA。使用real-time PCR試劑盒檢測miR-301a的表達。檢測 miR-301a 的相對表達量，每個樣品設置3個復孔。miR-301a 以U6 為內參，相對表達量結果應用 2-△△Ct法計算。其中，△Ct=(目的基因Ct-內參Ct)的平均值±標準偏差; △△Ct=(待測樣品中目的基因△Ct-參照樣品中目的基因△Ct)的平均值±標準偏差；2-△△Ct反映各樣品相對NC組樣品目的基因的相對表達水平。

1.2.3 Transwell侵襲小室實驗 采用Corning公司的transwell小室，上、下小室各加 500 μL 無血清培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱中放置 2 h使Matrigel 基質層再水化，將小室轉移至新的孔板中，除去上室中培養(yǎng)基并加入500 μL細胞懸液，下室內加入750 μL 30% FBS培養(yǎng)基。倒扣小室于吸水紙上以去除培養(yǎng)基，移去小室內非侵襲細胞，0.5%結晶紫水溶液染色轉移細胞5 min，沖洗小室，室溫下晾干，侵襲細胞顯微鏡下拍照。

1.2.4 MTT實驗 將轉染后的MDA-MB-231 細胞加入96孔板，培養(yǎng)細胞24、48 和72 h。72 h后每孔加入MTT液20 μL, 37 ℃下繼續(xù)孵育3 h，棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，震蕩10 min，選擇595 nm波長在酶標儀測定各孔OD值并記錄。

1.2.5 熒光素酶報告實驗 生物信息學軟件Targetscan(http://www.targetscan.org/vert_72/)預測miR-301a的靶基因，進行熒光素酶報告實驗驗證，將細胞接種至12孔板中，等待細胞融合達70%～80%，分別向細胞中轉染野生型MEOX2基因熒光載體和miR-301a mimics或NC，48 h后收集細胞，參照雙熒光素酶報告實驗試劑盒說明，檢測細胞的熒光素酶活性。

1.2.6 Western-blot實驗 收集轉染慢病毒載體后的細胞，PMSF裂解液冰上裂解30 min，加入蛋白酶抑制劑；4 ℃離心5 min，收集上清液，加入5XSDS上樣緩沖液，煮沸10 min，放于-20 ℃保存；配膠，上樣，SDS-PAGE電泳，轉膜，室溫下封閉1 h，一抗4 ℃過夜孵育，TBST洗5次，每次5 min，室溫下二抗孵育1 h后，TBS-T洗5次，每次5 min，進行化學發(fā)光反應。

2 結果

2.1 miR-301a在TNBC細胞中呈高表達 應用real-time PCR檢測TNBC細胞株MDA-MB-231與人正常乳腺上皮細胞株MCF-10A中miR-301a的表達水平，結果表明，miR-301a在MDA-MB-231細胞中的表達水平明顯高于MCF-10A細胞(P<0.05)，見圖1。

圖1 miR-301a在MDA-MB-231和MCF-10A細胞株中的表達

2.2 miR-301a促進MDA-MB-231細胞的侵襲 將miR-301a minics、miR-301a inhibitor分別轉染至MDA-MB-231細胞，real-time PCR檢測結果顯示，miR-301a mimics可明顯上調MDA-MB-231細胞中miR-301a的表達水平(P<0.05)，miR-301a inhibitor能夠明顯下調MDA-MB-231細胞中miR-301a的表達水平(P<0.05)(圖2)。Transwell侵襲實驗結果顯示，Minics miR-301a 組穿過小室膜的細胞數目(53±2.14)高于Minics NC組(41±3.96)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

圖2 各組 MDA-MB-231細胞中miR-301a表達水平

2.3 miR-301a對TNBC細胞增殖的影響 MTT實驗結果證明，將miR-301a minics轉染至MDA-MB-231細胞48、72 h后，細胞增殖能力明顯增強(P<0.05)，而轉染miR-301a inhibitor 48、72h后，MDA-MB-231細胞增殖能力明顯被抑制(P<0.05)。結果提示過表達miR-301a能夠增強MDA-MB-231細胞的增殖能力，見圖4。

圖3 Transwell實驗觀察過表達miR-301a對MDA-MB-231細胞侵襲的影響

圖4 MTT實驗檢測miR-301a表達對MDA-MB-231細胞增殖能力的影響

2.4 miR-301a 的靶基因分析 應用生物信息學軟件Targetscan預測發(fā)現MEOX2是miR-301a可能的靶基因，結合位點見圖5A。進一步采用雙熒光素酶報告基因分析驗證，MEOX2野生型質粒(MEOX2-3′UTR-WT)和miR-301a mimics共轉染后，熒光素酶活性下降(P<0.05), MEOX2突變型(MEOX2-3′UTR-MUT)和miR-301a mimics共轉染后，熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)，提示miR-301a可通過此結合位點被MEOX2靶向，見圖5B。

圖5 miR-301a的靶基因分析

2.5 Western-blot檢測過表達與下調miR-301a對MDA-MB-231細胞MEOX2蛋白的影響 MDA-MB-231細胞過表達miR-301a后，收集細胞總蛋白進行Western-blot檢測。結果顯示： Mimics miR-301a組MEOX2蛋白表達量明顯低于Mimics NC組和空白組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而Mimics NC組和空白組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結果提示過表達miR-301a可降低MEOX2蛋白的表達。

MDA-MB-231細胞轉染miR-301ainhibitor下調miR-301a后，收集細胞總蛋白進行Western-blot檢測。結果顯示：Inhibitor miR-301a組MEOX2蛋白表達量明顯高于Inhibitor NC組和空白組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而Inhibitor NC組和空白組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖6)。結果提示抑制miR-301a表達可提高MEOX2蛋白的表達。

圖6 Western blot 驗證各組細胞MEOX2蛋白表達

3 討論

乳腺癌是全球女性中發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其中TNBC占乳腺癌的10%～17%，其特點是雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人表皮生長因子受體(HER-2)均為陰性，具有較高的侵襲性、復發(fā)轉移率高，缺乏有效的靶向治療方案，預后較差[6-9]，因此針對TNBC的靶向治療是目前的研究熱點。

多種miRNAs已被證明是三陰性乳腺癌的潛在標志物[10]，miRNAs通過與靶mRNA 3′-UTR區(qū)完全或部分互補結合，導致靶mRNA降解或轉錄后翻譯抑制,從而調控靶基因的表達[11]，最終可影響TNBC的高侵襲性生物學行為[12]。miR-301a是近年發(fā)現的一種促癌miRNA，其在多種惡性腫瘤，如前列腺癌、胃癌、肝癌、結直腸癌中高表達，參與腫瘤的調控，研究發(fā)現miR-301a可提高前列腺癌細胞克隆形成能力及增殖能力[13]，miR-301a可通過靶向SOCS6與TGFBR2增強結直腸癌侵襲性[2,14]，文獻報道m(xù)iR-301a表達上調與三陰性乳腺癌的預后呈負相關[15]，但其對于TNBC的發(fā)生、發(fā)展作用罕有報道，本研究證實miR-301a在MDA-MB-231細胞系中表達量顯著上調,當miR-301a水平上調，MDA-MB-231細胞的侵襲、增殖能力隨之增強；當miR-301a水平抑制，MDA-MB-231細胞的侵襲、增殖能力隨之下降，表明miR-301a是TNBC的促癌基因，能夠促進TNBC細胞的侵襲與增殖。

本研究中，來自生物信息學軟件Targetscan的結果顯示，miR-301a能夠與MEOX2基因的3′-UTR結合，認為MEOX2為miR-301a的潛在靶基因。MEOX2也稱生長停滯特異性同源框蛋白(GAX)[16],有研究表明其參與調控多種細胞的增殖與分化，特別是對癌細胞增殖活力的調控也是最近的研究熱點[17-18]。國內學者曾報道在乳腺癌中MEOX2可作為PI3K/AKT信號通路的上游因子，影響乳腺癌細胞的周期，減少細胞的有絲分裂，進而抑制乳腺癌細胞的增殖[19]。因此，結合本研究結果推測，miR-301a可能通過靶向作用于MEOX2發(fā)揮其促TNBC的作用。為證實MEOX2為miR-301a的靶基因，本研究應用熒光素酶報告實驗和Western blot實驗對二者進行驗證，結果提示，MEOX2 mRNA的3′-UTR是miR-301a的靶點，miR-301a可與MEOX2靶向結合負向調控TNBC細胞中的MEOX2表達水平。故推測，TNBC細胞中miR-301a可通過下調MEOX2來影響PI3K/AKT信號通路的調節(jié)，PI3K/AKT信號通路是促進乳腺癌細胞增殖、轉移以及抑制細胞凋亡的關鍵通路，為治療TNBC提供重要靶點[20]。然而miR-301a/MEOX2軸是否通過PI3K/AKT信號通路進行調控TNBC的侵襲與增殖仍需更深入的研究。

4 結論

miR-301a在TNBC中高表達，并可通過靶向作用于MEOX2促進TNBC細胞的侵襲、增殖，從而作為TNBC的促癌基因發(fā)揮作用。