大腸桿菌O157∶H7噬菌體EC-p9的內(nèi)溶酶和穿孔素的特性預(yù)測及克隆表達(dá)

解天慧,石慧

(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院,重慶,400715)

大腸桿菌O157∶H7是腸出血性大腸桿菌中最典型的一種食源性致病菌,因產(chǎn)生志賀毒素從而引起腹瀉、出血性結(jié)腸炎、溶血性尿毒綜合癥等疾病,嚴(yán)重時(shí)有可能導(dǎo)致死亡[1-2]。但用抗生素控制大腸桿菌O157∶H7存在爭議,因?yàn)榭股乜赡軐?dǎo)致志賀毒素被大量釋放[3]。臨床實(shí)驗(yàn)表明,抗生素治療可能增加溶血性尿毒綜合癥的風(fēng)險(xiǎn)[3-4]。另外,抗生素的濫用致使耐藥性大腸桿菌O157的數(shù)量增加[3,5]。因此,尋找新型的抗菌物質(zhì)刻不容緩。

近幾年,噬菌體作為一種新型的抑菌劑開始被大量研究,食源性致病菌的噬菌體被分離,并應(yīng)用于醫(yī)療、食品等多個(gè)領(lǐng)域[3,6-7]。但噬菌體作為活體病毒,不易保存且不易被人們接受,而具有抑菌作用的內(nèi)溶酶和穿孔素能很好地解決這些問題[8]。穿孔素和內(nèi)溶酶在噬菌體裂解細(xì)菌中發(fā)揮著重要的作用,“穿孔素-內(nèi)溶酶”裂解體系是dsDNA噬菌體經(jīng)典的裂解系統(tǒng)[9-10]。內(nèi)溶酶是一種由dsDNA噬菌體編碼的酶,可降解細(xì)菌的肽聚糖并導(dǎo)致細(xì)菌死亡[8,11]。高效、抑菌譜寬、不容易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)使內(nèi)溶酶開始應(yīng)用于醫(yī)療、食品安全、病原菌檢測等各個(gè)方面[8,11-12]。穿孔素是一種含有跨膜結(jié)構(gòu)的疏水蛋白。在噬菌體裂解細(xì)菌過程中,通過在細(xì)胞膜上形成孔徑,協(xié)助內(nèi)溶酶與肽聚糖接觸[13]。

本實(shí)驗(yàn)分離得到1株大腸桿菌O157∶H7噬菌體EC-p9，通過十聚體寡核苷酸隨機(jī)引物PCR擴(kuò)增對(duì)該噬菌體進(jìn)行初步鑒定,并通過生物信息學(xué)對(duì)該噬菌體的內(nèi)溶酶和穿孔素的生理特征及跨膜結(jié)構(gòu)等進(jìn)行預(yù)測。最后,用大腸桿菌表達(dá)體系獲得內(nèi)溶酶Lys 9和穿孔素Hol 9。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

噬菌體為本實(shí)驗(yàn)室分離保存的烈性大腸桿菌O157∶H7噬菌體EC-p9。感受態(tài)大腸桿菌Trans1-T1、BL21(DE3)和載體pEasy-Blunt E1，北京全式金生物有限公司。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

LB肉湯和TSA培養(yǎng)基,青島海博生物技術(shù)有限公司；氨芐青霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside IPTG)、咪唑、SDS-PAGE凝膠試劑盒,索萊寶生物技術(shù)有限公司；Ni-IDA填料、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、蛋白和DNA Marker,PCR擴(kuò)增所用的酶和試劑,北京全式金生物有限公司；噬菌體DNA提取試劑盒,艾德萊生物有限公司；本研究所用DNA引物的合成和PCR產(chǎn)物的測序均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成,DNA引物見表1。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers in this study

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 噬菌體的初步鑒定

用試劑盒提取噬菌體EC-p9的DNA,以此為模板,用引物208、228、242、270、272、275、277和287進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件如下：在94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min,34 ℃復(fù)性1 min,72 ℃延伸2 min,共45個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果,選擇條帶少且亮PCR產(chǎn)物進(jìn)行再次擴(kuò)增,將產(chǎn)物膠回收后進(jìn)行TA克隆并測序。通過國際生物技術(shù)信息中心(NCBI)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行相似性比對(duì)，確定噬菌體的種類。根據(jù)相似度最高的噬菌體內(nèi)溶酶和穿孔素的基因設(shè)計(jì)噬菌體EC-p9的內(nèi)溶酶Lys 9和穿孔素Hol 2的引物。以噬菌體EC-p9的DNA為模板,Lys 9-F和Lys 9-R(Hol 9-F和Hol 9-R)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s,55 ℃復(fù)性30 s,72 ℃延伸1 min,共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。檢測PCR產(chǎn)物并送往上海生工測序。

1.2.2 內(nèi)溶酶Lys 9和穿孔素Hol 9特性預(yù)測

利用NCBI提供的局域相似性比對(duì)工具(BLAST)(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行相似性分析。分別利用ExPASy ProtParamtool (https://web.expasy.org/protparam/)、SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/)和TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對(duì)內(nèi)溶素和穿孔素的理化特征、二級(jí)結(jié)構(gòu)和跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。

1.2.3 質(zhì)粒pEASY-Lys 9和pEASY-Hol 9的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

按1∶7的摩爾質(zhì)量比分別加入質(zhì)粒pEasy-Blunt E1和內(nèi)溶酶Lys 9或穿孔素Hol 9的基因,25 ℃反應(yīng)5 min。然后加入50 μL Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞(剛解凍轉(zhuǎn)化效果最好)混勻,冰浴30 min后,42 ℃水浴30 s,立刻置于冰中2 min。加入250 μL LB肉湯,在200 r/min、37 ℃的條件下培養(yǎng)1 h。將8 μL 500 mmol/L IPTG和40 μL 20 g/L X-gal混合均勻。并涂布在TSA平板(含100 g/L Amp+)上,37 ℃放置30 min后,取200 μL菌液涂布到平板上37 ℃過夜培養(yǎng)。隨機(jī)挑取白色的單克隆進(jìn)行菌落PCR、引物為載體pEasy-Blunt E1中配套的T7 promoter primer和目的基因的下游引物(Lys 9-R或Hol 9-R)。將驗(yàn)證正確的單克隆經(jīng)搖瓶培養(yǎng)后提取質(zhì)粒送到上海生工測序。將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)到大腸桿菌BL21(DE3)。

1.2.4 內(nèi)溶酶Lys 9的最佳誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑濃度

1.2.4.1 最佳誘導(dǎo)時(shí)間

挑取含有pEASY-Lys 9的BL21(DE3)到5 mL LB(含100 g/L Amp+)中,37 ℃,120 r/min培養(yǎng)16 h。按1%的接種量接種到100 mL的LB(含100 g/L Amp+),于37 ℃,200 r/min培養(yǎng)2～3 h(OD600為0.4～0.6)。加入終濃度為1 mmol/L的IPTG,在37 ℃、200 r/min的條件下誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。誘導(dǎo)過程中每隔1 h取1 mL細(xì)菌樣本,共8 h。取樣后,迅速在4 ℃、12 000 r/min的條件下離心1 min。去除上清液,用36 μL無菌ddH2O重懸,加入4 μL的4×SDS-PAGE Loading Buffer混勻并煮沸3～5 min。待所有樣本制備完成后進(jìn)行SDS-PAGE電泳,從而檢測不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)內(nèi)溶酶Lys 9表達(dá)的影響。

1.2.4.2 最佳IPTG誘導(dǎo)濃度

在OD600為0.4～0.6含有pEASY-Lys 9的BL21(DE3)中,分別加入終濃度為0.1、0.5、1、2、5 mmol/L的IPTG,并在 37 ℃,200 r/min的條件下振動(dòng)培養(yǎng)5 h。每個(gè)濃度取1 mL細(xì)菌樣本,按1.2.3.1小節(jié)的方法制備SDS-PAGE電泳上樣液,并進(jìn)行SDS-PAGE電泳,從而檢測不同濃度的誘導(dǎo)劑對(duì)內(nèi)溶酶Lys 9表達(dá)的影響。

1.2.5 穿孔素Hol 9的誘導(dǎo)表達(dá)

1.2.5.1 穿孔素Hol 9表達(dá)對(duì)大腸桿菌BL21(DE3)的作用

挑取含有pEASY-Hol 9的BL21(DE3)到5 mL的LB(含100 g/L Amp+)中,37 ℃,120 r/min培養(yǎng)16 h。按1%的接種量接種到100 mL的LB(含100 g/L Amp+),37 ℃培養(yǎng)5 h(OD600為0.4～0.6),加入終濃度為1 mmol/L的IPTG。在 37 ℃,200 r/min的條件下振動(dòng)培養(yǎng)。在誘導(dǎo)過程中每隔20 min取菌液樣品,并測定菌液OD600值,共測定2 h。根據(jù)細(xì)菌生長曲線的變化趨勢,確定穿孔素Hol 9最佳表達(dá)時(shí)間并且描述Hol 9表達(dá)對(duì)細(xì)菌生長速度的影響。

在OD600值為0.4～0.6,含有pEASY-Hol 9的BL21(DE3)中,按1.2.3.2小節(jié)的方法檢測不同濃度IPTG對(duì)穿孔素Hol 9表達(dá)的影響。其中誘導(dǎo)時(shí)間為30 min,其他條件不變。

1.2.6 重組蛋白的純化

按最佳誘導(dǎo)條件表達(dá)內(nèi)溶酶Lys 9和穿孔素Hol 9,誘導(dǎo)表達(dá)的菌液總體積為400 mL。誘導(dǎo)結(jié)束后,于8 000 r/min離心10 min,收集細(xì)菌沉淀。細(xì)菌沉淀用100 mL 無菌Tris-NaCl緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl,500 mmol/L NaCl,pH 7.5)重懸,并在冰浴條件下超聲破菌(120 W,工作3 s,間歇10 s,共 10 min)。將超聲破碎后的產(chǎn)物在4 ℃、13 000 r/min下離心1 h,上清液用0.45 μm的濾膜過濾。將5 mL Ni-NTA填料裝入柱子中,用25 mL Tris-NaCl緩沖液平衡柱子；將過濾后的上清液加入柱子,填料重懸,上清液自然流出并收集穿透液。再用25 mL Tris-NaCl緩沖液清洗柱子并收集洗滌液后,分別用50 mL 20 mmol/L和50 mmol/L的咪唑洗脫雜蛋白,并收集洗脫液。分別用10 mL 200 mmol/L和500 mmol/L的咪唑洗脫目的蛋白。將純化好的目的蛋白用0.22 μm的濾膜過濾后加入20%的甘油,保存于-20 ℃,并進(jìn)行SDS-PAGE檢測。用微量紫外分光光度計(jì)檢測蛋白濃度。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 噬菌體的初步鑒定

如圖1-b所示,用引物270擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的條帶少且亮,將產(chǎn)物再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物如圖1-c所示。最終回收到一段700～800 bp的DNA片段,克隆測序并將序列通過Blasts工具對(duì)比,結(jié)果顯示,噬菌體EC-p9與大腸桿菌噬菌體PE37相識(shí)度最高為81.20%。根據(jù)Escherichia phage PE37內(nèi)溶酶和穿孔素的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物,調(diào)取噬菌體EC-p9的內(nèi)溶酶Lys 9和穿孔素Hol 9的核苷酸序列,獲得長度分別為800和700 bp左右的PCR產(chǎn)物,見圖1-d。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測噬菌體EC-p9的DNA(a)、噬菌體的隨機(jī)引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物(b)、引物270的在擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物(c)和噬菌體內(nèi)溶酶和穿孔素的PCR產(chǎn)物(d)Fig.1 EC-p9 DNA (a),PCR products of random primer amplification of phage (b),PCR products by 270 primer (c) and PCR products of Lys 9 and Hol 9 (d) by agarose gel electrophoresis注：M為marker;圖a中,1和2為DNA。圖b中,1、2、3、4、5、6、7和8分別為引物208、228、241、270、272、275、277和287的產(chǎn)物;圖c中,1為引物270的PCR再擴(kuò)增產(chǎn)物;圖d中,1和2分別穿孔素Hol 9 和內(nèi)溶酶Lys 9的基因片段

2.2 內(nèi)溶酶Lys 9和穿孔素Hol 9的特性預(yù)測

2.2.1 內(nèi)溶酶Lys 9和穿孔素Hol 9的理化性質(zhì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用ExPASy Prot Paramtool預(yù)測內(nèi)溶酶Lys 9和穿孔素Hol 9的特性,如表2所示。利用SOPMA內(nèi)溶酶Lys 9和穿孔素Hol 9的二級(jí)結(jié)構(gòu),內(nèi)溶酶Lys 9的α-螺旋、β-折疊、延長鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲分別占氨基酸總數(shù)的54.62%、0%、9.62%、8.85%和36.92%。穿孔素Hol 9的α-螺旋、β-折疊、延長鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲分別占氨基酸總數(shù)的44.44%、0%、13.43%、5.09%和37.04%。

表2 內(nèi)溶酶Lys 9和穿孔素Hol 9的理化性質(zhì)Table 2 The physicochemical properties of endolysin Lys9 and holin Hol 9

2.2.2 內(nèi)溶酶Lys 9和穿孔素Hol 9的結(jié)構(gòu)域預(yù)測

式中:為載體坐標(biāo)系(B系)至地理坐標(biāo)系(L系)的坐標(biāo)轉(zhuǎn)換矩陣;fB為比力;為地固坐標(biāo)系(E系)相對(duì)于慣性坐標(biāo)系(i系)的角速度轉(zhuǎn)換到L系上的角速度向量的反對(duì)稱矩陣;為L系相對(duì)于B系的旋轉(zhuǎn)角速度向量的反對(duì)稱矩陣;gL為當(dāng)?shù)厮阶鴺?biāo)系里重力向量。

利用Pfam數(shù)據(jù)庫檢索,對(duì)內(nèi)溶酶Lys 9和穿孔素的Hol 9的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測,見圖2。結(jié)果表明,內(nèi)溶酶Lys 9具有2個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域,其中1個(gè)為N端酶活結(jié)構(gòu)域,屬于Muraidase家族,能裂解β-1,4-糖苷鍵,是N-乙酰胞壁酸酶；另1個(gè)為肽聚糖結(jié)合域,屬于PG_binding_1家族。穿孔素Hol 9含有1個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域,屬于Bacteriophage T holin家族,能破壞細(xì)胞,并傳遞信息來控制細(xì)胞的裂解時(shí)間。

圖2 內(nèi)溶酶Lys 9(a)和穿孔素Hol 9(b)的結(jié)構(gòu)域Fig.2 The structural domain of endolysin Lys 9 (a) and holin Hol 9 (b)

2.2.3 內(nèi)溶酶Lys 9和穿孔素Hol 9的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用TMHMM Server v.2.0對(duì)內(nèi)溶酶Lys 9和穿孔素Hol 9的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測,見圖3。結(jié)果顯示,內(nèi)溶酶Lys 9沒有跨膜結(jié)構(gòu)；穿孔素Hol 9在N端1～26位氨基酸處于胞內(nèi),47～126位氨基酸處于胞外,在27～46位氨基酸形成一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)。

2.3 內(nèi)溶酶Lys 9和穿孔素Hol 9質(zhì)粒的構(gòu)建

按照1.2.2小節(jié)的方法構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pEASY-Lys 9和pEASY-Hol 9,用菌落PCR驗(yàn)證重組質(zhì)粒pEASY-Lys 9和pEASY-Hol 9。結(jié)果如圖4所示,PCR產(chǎn)物在700 bp(泳道6)和800 bp(泳道7、8和9)左右有明顯的條帶,這與穿孔素和內(nèi)溶酶的基因大小一致,表明獲得了表達(dá)方向正確的重組表達(dá)質(zhì)粒。

圖3 內(nèi)溶酶Lys 9的跨膜結(jié)構(gòu)(a)和穿孔素Hol 9的跨膜結(jié)構(gòu)(b)Fig.3 Transmembrane structure of endolysin Lys 9 (a) and holin Hol 9 (b)

圖4 瓊脂糖凝膠電泳分析質(zhì)粒(a)和菌落PCR產(chǎn)物(b)Fig.4 Plasmid (a) and PCR products of colony (b) by agarose gel electrophoresis注：M為marker;圖a中,1和2分別為pEASY-Hol 9和pEASY-Lys 9;圖b中,1-6為穿孔素的白色單克隆的菌落PCR產(chǎn)物,7-10為內(nèi)溶酶的白色單克隆的菌落PCR產(chǎn)物

2.4 內(nèi)溶酶Lys 9的表達(dá)和純化

2.4.1 內(nèi)溶酶Lys 9最佳誘導(dǎo)條件的確定

內(nèi)溶酶Lys 9在表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)中大量表達(dá),在30 kDa左右出現(xiàn)明顯條帶,與預(yù)測的內(nèi)溶酶Lys 9的分子質(zhì)量一致。不含重組蛋白基因的空質(zhì)粒經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后無法檢測到相應(yīng)的蛋白,因此內(nèi)溶酶在含有pEASY-Lys 9質(zhì)粒的BL21(DE3)成功表達(dá)。由圖5-a可見,內(nèi)溶酶的表達(dá)量隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長而逐漸增加,在誘導(dǎo)5 h后表達(dá)量到達(dá)峰值,因此最佳誘導(dǎo)時(shí)間為5 h。由圖5-b可見,當(dāng)IPTG的濃度在1和2 mmol/L時(shí)表達(dá)量最大,出于經(jīng)濟(jì)方面的考慮將最佳誘導(dǎo)濃度定為1 mmol/L。

圖5 不同誘導(dǎo)時(shí)間(a)和IPTG濃度(b)對(duì)Lys 9表達(dá)量的影響Fig.5 Effect of different induced time (a) and IPTG concentration (b) on the amount of expression of Lys 9注：M為marker;圖a中:1-9分別代表誘導(dǎo)時(shí)間0 h到8 h,其中時(shí)間間隔為1 h;圖b中,1-5分別代表濃度為0.1、0.5、1、2、5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo),6為不含內(nèi)溶酶Lys 9的空質(zhì)粒

2.4.2 內(nèi)溶酶Lys 9的純化

采用超聲破碎法破碎重組大腸桿菌BL21(DE3),將獲得的沉淀、上清液和鎳柱純化收集的所有液體進(jìn)行SDS-PAGE電泳。如圖6所示,內(nèi)溶酶Lys 9主要以可溶性蛋白的形式存在上清液中,且在33 kDa到26 kDa左右出現(xiàn)明顯條帶,目的蛋白被200 mmol/L咪唑大量洗脫,洗脫液中不含雜蛋白。

M-marker;1-菌體;2-超聲破菌后的上清液;3-超聲破菌后的沉淀;4-上清液的穿過峰;5-緩沖液洗脫峰;6-9分別為濃度為20、50、200、500 mmol/L的咪唑洗脫液圖6 內(nèi)溶酶Lys 9的純化Fig.6 The purification of endolysin Lys 9

2.5 穿孔素的Hol 9表達(dá)純化

2.5.1 穿孔素Hol 9表達(dá)對(duì)表達(dá)感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)生長抑制分析

將含有pEASY-Hol 9的BL21(DE3)和含有pEASY-Blunt E1的BL21(DE3)在37 ℃、200 r/min的條件下培養(yǎng)5 h后,OD600值分別為0.411和0.626。在此基礎(chǔ)上加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)穿孔素表達(dá)。在誘導(dǎo)過程中,通過測定表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)的濁度來監(jiān)測穿孔素對(duì)表達(dá)蛋白的影響,從而確定表達(dá)時(shí)間,如圖7所示。結(jié)果顯示,在加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)之前,pEASY-Hol 9的BL21(DE3)的OD600值比含有EASY-Blunt E1的BL21(DE3) OD600值低了0.2左右；含有pEASY-Hol 9質(zhì)粒的BL21(DE3)誘導(dǎo)20 min后,細(xì)菌的濃度最大,其OD600值為0.427。之后隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長,pEASY-Hol 9質(zhì)粒的BL21(DE3)的OD600值逐漸降低,在120 min后低至0.280。而含有pEASY-Blunt E1質(zhì)粒的BL21(DE3)菌液濃度隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加而增加。因此,穿孔素Hol 9的最佳表達(dá)時(shí)間為20 min。

圖7 內(nèi)溶酶Lys 9和穿孔素Hol 9的表達(dá)對(duì)BL21生長的影響Fig.7 Effect of expression of endolysin Lys 9 and holin Hol 9 on growth of BL21

2.5.2 穿孔素Hol 9表達(dá)的最佳IPTG濃度和穿孔素的純化

圖8 不同IPTG濃度對(duì)穿孔素Hol 9表達(dá)量的影響(a)和穿孔素Hol 9的純化(b)Fig.8 Effect of different IPTG concentrations on amount of expression of holin Hol 9 (a) and the purification of holin Hol 9 (b)注：M為marker;圖a中1-5分別代表濃度為0.1、0.5、1、2、5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo),6為不含穿孔素Hol 9的空質(zhì)粒;圖b中,1為上清液,2為穿過峰,3為洗脫液,4-7分別為濃度為20、50、200、500 mmol/L的咪唑洗脫液

由圖8-a可見,不同濃度的IPTG誘導(dǎo)對(duì)穿孔素Hol 9表達(dá)量沒有明顯差異,與空質(zhì)粒相比穿孔素的表達(dá)導(dǎo)致了在分子質(zhì)量為35 kDa處的蛋白缺失。如圖8-b所示,重組蛋白在26 kDa左右出現(xiàn)明顯條帶,用200 mmol/L咪唑洗滌鎳柱時(shí),目的蛋白被大量洗脫,且洗脫液不含雜蛋白。

2.6 內(nèi)溶酶Lys 9和穿孔素Hol 9的濃度測定

利用微量紫外分光光度計(jì)對(duì)純化的內(nèi)溶酶Lys 9和穿孔素Hol 9的質(zhì)量濃度進(jìn)行測定,內(nèi)溶酶Lys 9溶液的質(zhì)量濃度為2.49 g/L；穿孔素Hol 9溶液的質(zhì)量濃度為0.95 g/L。

3 討論

大腸桿菌O157∶H7是一種嚴(yán)重危害公共衛(wèi)生安全的食源性致病菌,能在食品加工和貯藏中的相關(guān)脅迫誘導(dǎo)下發(fā)生交叉適應(yīng),使細(xì)菌在后續(xù)殺菌或抑菌處理中得以存活[15]。耐藥性大腸桿菌的出現(xiàn)也增加了人類大腸桿菌的風(fēng)險(xiǎn)。噬菌體內(nèi)溶酶和穿孔素作為新型抑菌物質(zhì)能用于控制對(duì)人體健康造成威脅的病原菌。本研究中,對(duì)篩選的噬菌體EC-p9進(jìn)行了初步鑒定,發(fā)現(xiàn)其與大腸桿菌噬菌體PE37 tRNA簇的相識(shí)最高為81.20%。根據(jù)NCBI提供的信息可知,噬菌體PE37屬于dsDNA肌尾科噬菌體。因而,噬菌體EC-p9可能是dsDNA肌尾科噬菌體,其裂解體系為“穿孔素-內(nèi)溶酶”。“穿孔素-內(nèi)溶酶”裂解體系是dsDNA噬菌體的經(jīng)典的裂解系統(tǒng),如λ和 T4 等[16]。

穿孔素和內(nèi)溶酶作為廣譜抑菌劑,在控制食源性致病菌中表現(xiàn)出巨大的潛力。YU等[12]和SONG等[17]分別研究了內(nèi)溶酶LysSAP8和穿孔素GH15對(duì)金黃色葡萄球菌抑制能力。本研究利用生物信息學(xué)分析了EC-p9的內(nèi)溶酶Lys 9和穿孔素Hol 9。革蘭氏陰性菌噬菌體的內(nèi)溶酶通常為球形結(jié)構(gòu),并且缺乏細(xì)胞結(jié)合域[18-20]。但噬菌體EC-p9的內(nèi)溶酶Lys 9具備兩個(gè)結(jié)構(gòu)域,其催化活性結(jié)構(gòu)域?qū)儆贜-乙酰胞壁酸酶,能裂解β-1,4-糖苷鍵；另外,還具有一個(gè)肽聚糖結(jié)合域。穿孔素Hol 9是典型Ⅲ型穿孔素[21],只有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu),N端在胞內(nèi),C端在胞內(nèi),主要作用是破壞細(xì)胞膜,傳遞信息,控制噬菌體裂解細(xì)菌的時(shí)間。

本研究利用大腸桿菌表達(dá)體系獲得內(nèi)溶酶Lys 9和穿孔素Hol 9。內(nèi)溶酶Lys 9的最佳表達(dá)條件是在37 ℃、1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)5 h。在該條件下,利用鎳柱純化獲得為2.49 mg/mL的內(nèi)溶酶Lys 9溶液。但穿孔素Hol 9的表達(dá)對(duì)大腸桿菌BL21(DE3)具有毒害作用[18,21]。在加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)前,含有pEASY-Hol 9的大腸桿菌BL21(DE3)的生長速度比含有空質(zhì)粒和pEASY-Lys 9的BL21(DE3)的生長速度慢。這可能是穿孔素Hol 9在不含誘導(dǎo)劑的情況下少量表達(dá),導(dǎo)致BL21(DE3)裂解死亡。在IPTG表達(dá)20 min后菌液濃度達(dá)到最高點(diǎn),因此穿孔素Hol 9的最佳表達(dá)時(shí)間是20 min。且不同濃度的IPTG對(duì)穿孔素Hol 9的表達(dá)量沒有影響。利用鎳柱純化穿孔素Hol 9獲得質(zhì)量濃度為0.95 mg/mL的穿孔素Hol 9溶液。

總之,本研究利用隨機(jī)引物初步鑒定了噬菌體EC-p9,并利用生物信息學(xué)分析該噬菌體的內(nèi)溶酶和穿孔素,并成功表達(dá)了噬菌體EC-p9的內(nèi)溶酶和穿孔素。該研究為后續(xù)內(nèi)溶酶和穿孔素的抑菌特性的研究以及噬菌體EC-p9的裂解機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。