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    人參皂苷Rg1對大鼠阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征引起的肺損傷及Nrf2/HO-1信號通路的影響

    2021-05-21 00:53:06田嬋嬋王宏志馬欣悅
    實用藥物與臨床 2021年4期
    關(guān)鍵詞:低氧皂苷人參

    田嬋嬋,王宏志,馬欣悅

    0 引言

    阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(Obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome,OSAHS)是世界上最普遍的慢性呼吸系統(tǒng)疾病[1]。OSAHS會導(dǎo)致短暫的呼吸停止(呼吸暫停)或睡眠期間流量明顯減少(呼吸不足)[2],其中男性的發(fā)病率為22%(9%~37%),女性的發(fā)病率為17%(4%~50%)[3]。慢性間歇性低氧(Chronic intermittent hypoxia,CIH)是OSAHS的主要病理特征,表現(xiàn)為睡眠中反復(fù)出現(xiàn)缺氧和復(fù)氧情況,是OSAHS導(dǎo)致心腦血管并發(fā)癥的主要因素[4]。OSAHS引起組織損傷,特別是在肺組織中,CIH可能引起肺部炎癥,導(dǎo)致肺纖維化[5]。

    研究發(fā)現(xiàn),Nrf-2是人體抵抗氧化應(yīng)激的重要調(diào)節(jié)劑,可以預(yù)防多種氧化應(yīng)激疾病,例如癌癥、高血壓、肺纖維化、腎纖維化、阿爾茨海默病[6-7]。作為血紅素加氧酶家族的成員,HO-1在抗炎、抗氧化和凋亡抑制中起著至關(guān)重要的作用[8]。因此,Nrf2/HO-1信號通路已成為氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要信號途徑[9]。

    人參皂苷Rg1(GRg1)是一種四環(huán)三萜類化合物,是從人參提取的生物活性成分之一。多項研究表明,GRg1具有抗氧化活性[10],可有效減輕心臟、肝臟等的纖維化[11-12],還可抑制IL-6和TNF-α的表達(dá),減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[13-14]。

    本實驗通過建立CIH大鼠模型,研究人參皂苷Rg1對大鼠OSAHS引起的肺損傷及Nrf2/HO-1信號通路的影響,進一步探討其作用機制,為臨床治療OSAHS提供新的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 動物 60只SD大鼠(雄性,SPF級,6周,體重180~220 g)購自三峽大學(xué)實驗動物中心。實驗大鼠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動物房中,正常飲食飲水,實驗動物設(shè)計經(jīng)過我院倫理委員會審查。大鼠適應(yīng)環(huán)境2周后進行實驗。

    1.1.2 試劑 人參皂苷Rg1(HPLC≥98%)購自上海源葉生物科技有限公司。大鼠MDA試劑盒、大鼠SOD試劑盒、大鼠GSH試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司。大鼠TNF-α試劑盒、大鼠IL-1β試劑盒、大鼠IL-6試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司。HE試劑盒購自北京開瑞基生物科技有限公司。TRIzol試劑、PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒和SYBR?Premix EX TaqTMII試劑盒購自日本TaKaRa公司。RIPA裂解液、BCA試劑盒購自美國Abcam公司。兔抗COX-2抗體,兔抗iNOS抗體,兔抗HO-1抗體、兔抗Nrf2抗體、兔抗GAPDH抗體和山羊抗兔IgG抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

    1.2 方法

    1.2.1 大鼠CIH模型制備 造模:建立與OSAHS的病理生理特征相似的CIH動物模型。低氧艙內(nèi)先輸入壓縮空氣30 s,后輸入氮氣30 s,進行循環(huán)。實驗過程中注意檢測低氧艙內(nèi)的氧濃度,使艙內(nèi)氧濃度控制在8%~21%。實驗過程中艙內(nèi)產(chǎn)生的二氧化碳和水蒸氣被生石灰和硅膠吸取[15]。大鼠每天定時在低氧艙內(nèi)8 h,共4周。實驗結(jié)束后進行CIH模型鑒定。

    1.2.2 分組及給藥 ①分組:60只SD大鼠分為4組:對照組(control組)、慢性間歇性缺氧組(CIH組)、人參皂苷Rg1低劑量組(CIH+GRg1-L組)和人參皂苷Rg1高劑量組(CIH+GRg1-H組),每組15只,control組大鼠不予任何處理,CIH組、CIH+GRg1-L組和CIH+GRg1-H組按“1.2.1”進行模型制備。②給藥:給藥方式為灌胃,control組:無菌生理鹽水,4 ml/kg;CIH組:無菌生理鹽水,4 ml/kg;CIH+GRg1-L組:18 mg/kg的GRg1,給藥體積為4 ml/kg;CIH+GRg1-H組:36 mg/kg的GRg1,給藥體積為4 ml/kg[16]。于造模前經(jīng)灌胃相應(yīng)劑量的生理鹽水或GRg1。每天給藥1次,連續(xù)7 d。

    1.2.3 肺功能測定 在末次給藥2 h后,采用動物肺功能分析系統(tǒng)測定各組大鼠的肺功能,計算IC、PEF、FEV0.3和VE。

    1.2.4 MDA、SOD、GSH、TNF-α、IL-1β和IL-6的含量或活性測定 將各組大鼠肺組織放入到9倍體積的PBS中,用勻漿器分散到勻漿中,凍融3次,并在4 ℃以3 000 r/min 離心15 min,收集上清液。使用試劑盒分別檢測MDA、GSH、TNF-α、IL-1β、IL-6、TNF-α的含量及IL-1β、SOD的活性。

    1.2.5 HE染色 各組大鼠的肺組織在室溫下用4%多聚甲醛固定過夜,用水洗滌6 h,然后在梯度濃度的乙醇中脫水(70%,2 h;80%,過夜;90%,2 h;100%,1 h)。將組織浸入二甲苯中直至透明,然后在60 ℃的石蠟中包埋2 h。將組織塊切成5 μm薄片,在水中攤開并轉(zhuǎn)移到載玻片上,于60 ℃干燥24 h。將切片在二甲苯中脫蠟,以梯度濃度的乙醇(100%,5 min;95%,2 min;85%,2 min;75%,2 min)中脫水。然后將切片用蘇木精染色5 min,沖洗后再用伊紅染色3 min,在梯度濃度的乙醇中脫水(每次2 min,分別以75%、85%、95%的比例脫水;每次5 min,以100%的比例脫水),在二甲苯中透明2次,每次10 min。之后使用中性樹膠封片,使用光學(xué)顯微鏡觀察切片并拍照。

    1.2.6 qRT-PCR檢測 TRIzol試劑提取肺組織中的總RNA。使用紫外分光光度計檢測總RNA的含量,并將每個配對的樣品調(diào)節(jié)至相同濃度。使用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照SYBR Premix EX TaqTMII試劑盒進行qRT-PCR。qRT-PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 30 s(1循環(huán))95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s(40循環(huán))。

    使用StepOnePlus儀器完成實驗后,采用2-△△Ct法分析數(shù)據(jù)。引物見表1。

    1.2.7 Western blot檢測 使用全細(xì)胞裂解分析試劑盒從組織中提取總蛋白,并使用Nucleus Protein Extraction Kit從細(xì)胞核中提取蛋白。使用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度后,通過SDS-PAGE分離總蛋白質(zhì)和細(xì)胞核蛋白質(zhì);用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下用5%脫脂奶封閉1 h后,將PVDF膜與以下抗體在4 ℃孵育過夜:兔抗COX-2(1∶400)、兔抗iNOS(1∶400)、兔抗Nrf2(1∶400)、兔抗HO-1(1∶400)和兔抗GAPDH(1∶1 000)。隨后,將PVDF膜用TBST洗滌3次,持續(xù)5 min,并與山羊抗兔IgG-HRP(1∶5 000)孵育1 h,用TBST洗滌3次,持續(xù)5 min。最后顯影曝光,用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)對蛋白條帶的灰度值進行分析。

    表1 引物序列

    2 結(jié)果

    2.1 CIH模型的鑒定 大鼠在低氧艙內(nèi)的最后1 d,分別在低氧艙內(nèi)氧最低濃度和低氧艙內(nèi)氧最高濃度時,隨機對大鼠進行血氧飽和度和動脈血氣分析檢測,其血氧飽和度為70%~92%,動脈氧分壓為60.7~80.1 mmHg,接近OSAHS病理生理特點,因此CIH動物模型建立成功。

    2.2 各組大鼠肺功能的比較 與control組比較,CIH組大鼠IC、PEF、FEV0.3及VE均明顯降低(P<0.01);與CIH組比較,CIH+GRg1-L組和CIH+GRg1-H組大鼠IC、PEF、FEV0.3及VE均升高(P<0.01)。結(jié)果見表2。

    2.3 各組大鼠肺組織中MDA、SOD和GSH的表達(dá)變化 與control組比較,CIH組大鼠肺組織中MDA的含量明顯增加(P<0.01),SOD的活性和GSH的含量均明顯降低(P<0.001,P<0.01);與CIH組比較,CIH+GRg1-L組和CIH+GRg1-H組大鼠肺組織中MDA的含量均降低(P<0.05),SOD的活性和GSH的含量均升高(P<0.05)。結(jié)果見表3。

    表2 各組大鼠的IC、PEF、FEV0.3、VE比較

    表3 各組大鼠肺組織中MDA、GSH含量以及SOD活性比較

    2.4 各組大鼠肺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)變化 與control組比較,CIH組大鼠肺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量均顯著增加(P<0.01);與CIH組比較,CIH+GRg1-L組和CIH+GRg1-H組大鼠肺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量均降低(P<0.05)。結(jié)果見表4。

    2.5 各組大鼠肺組織的病理變化 control組大鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)正常,沒有炎性細(xì)胞浸潤;CIH組大鼠肺組織嚴(yán)重受損,肺泡結(jié)構(gòu)變形,上皮細(xì)胞變性,壞死脫落,并出現(xiàn)間質(zhì)水腫,肺泡中可見炎性細(xì)胞浸潤,大量液體滲出;CIH+GRg1-L組和CIH+GRg1-H組大鼠肺組織受損減輕,炎性細(xì)胞浸潤減少,肺部水腫也減輕。結(jié)果見圖1。

    表4 各組大鼠肺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)比較

    2.6 各組大鼠肺組織中COX-2和iNOS的表達(dá)變化 與control組比較,CIH組大鼠肺組織中COX-2 mRNA和iNOS mRNA表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P<0.001);與CIH組比較,CIH+GRg1-L組和CIH+GRg1-H組大鼠肺組織中COX-2 mRNA和iNOS mRNA表達(dá)水平均下調(diào)(P<0.05);由圖2B可知,與control組比較,CIH組大鼠肺組織中COX-2 蛋白和iNOS 蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P<0.001);與CIH組比較,CIH+GRg1-L組和CIH+GRg1-H組大鼠肺組織中COX-2蛋白和iNOS蛋白表達(dá)水平均下調(diào)(P<0.05)。見圖2。

    圖1 各組大鼠肺組織的病理變化

    圖2 各組大鼠肺組織中COX-2和iNOS的表達(dá)變化

    2.7 各組大鼠肺組織中Nrf2和HO-1的表達(dá)變化 與control組比較,CIH組大鼠肺組織中Nrf2 mRNA和HO-1 mRNA表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P<0.001);與CIH組比較,CIH+GRg1-L組和CIH+GRg1-H組大鼠肺組織中Nrf2 mRNA和HO-1 mRNA表達(dá)水平均下調(diào)(P<0.05);由圖3B可知,與control組比較,CIH組大鼠肺組織中Nrf2蛋白和HO-1蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P<0.001);與CIH組比較,CIH+GRg1-L組和CIH+GRg1-H組大鼠肺組織中Nrf2蛋白和HO-1蛋白表達(dá)水平均下調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見圖3。

    圖3 各組大鼠肺組織中Nrf2和HO-1的表達(dá)變化

    3 討論

    OSAHS是睡眠呼吸障礙的一種常見情況,其患病率在中老年人中為5%~14%[17]。OSAHS的病理生理學(xué)包括睡眠期間反復(fù)出現(xiàn)的部分或完全的上呼吸道阻塞,導(dǎo)致通氣不足、呼吸暫停、間歇性缺氧和高碳酸血癥[18]。OSAHS導(dǎo)致呼吸作用增加,交感興奮性增加,睡眠結(jié)構(gòu)改變和缺氧,這可能導(dǎo)致肺、心血管和腦血管事件,并引起代謝紊亂、神經(jīng)認(rèn)知功能障礙和其他疾病[19-20]。本研究采用低氧艙建立CIH模型大鼠,結(jié)果發(fā)現(xiàn),大鼠的肺功能明顯下降。

    研究發(fā)現(xiàn),ROS可以損傷細(xì)胞膜,被認(rèn)為是氧化應(yīng)激的標(biāo)志[21]。MDA是由ROS催化的脂質(zhì)氧化的最終產(chǎn)物,可攻擊細(xì)胞膜和電子傳輸鏈[22]。因此,本研究將MDA的水平作為氧化應(yīng)激反應(yīng)的生物標(biāo)志物進行了檢測。SOD是一種重要的抗氧化酶,與催化酶和過氧化物酶一起可消除ROS[23]。GSH是一種三肽,在由谷胱甘肽過氧化物酶催化的反應(yīng)中,被ROS氧化為谷胱甘肽二硫化物。然后,谷胱甘肽還原酶將谷胱甘肽二硫化物還原為GSH,以消除ROS[24]。本研究證明,CIH能引起氧化應(yīng)激反應(yīng),使MDA含量升高,SOD活性和GSH含量降低。在本研究中,肺組織中的TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)增加。TNF-α、IL-1β和IL-6均由白細(xì)胞產(chǎn)生,并在炎癥反應(yīng)中起重要作用[25-26]。這些結(jié)果的增加表明肺組織中存在炎癥。

    此外,CIH激活了缺氧誘導(dǎo)因子α,該因子刺激各種基因的轉(zhuǎn)錄,包括COX-2和iNOS[27]。在氧化應(yīng)激過程中,iNOS的表達(dá)迅速增加。iNOS表達(dá)受多種細(xì)胞因子誘導(dǎo),包括干擾素γ、IL-1、IL-6和TNF-α[28]。COX是前列腺素合成中的關(guān)鍵酶,而COX-2是可誘導(dǎo)的異構(gòu)體,具有抗炎和抗氧化的特性[29]。本研究發(fā)現(xiàn),CIH組大鼠肺組織中COX-2和iNOS蛋白明顯增加,與上述文獻(xiàn)報道一致。

    Nrf2是抗氧化的最重要調(diào)節(jié)劑。在常氧條件下,Nrf2通常在細(xì)胞質(zhì)中,但在氧化應(yīng)激的條件下,Nrf2轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中,激活抗氧化反應(yīng)元件,并促進下游基因的轉(zhuǎn)錄,包括GPx、SOD和HO-1[9]。HO-1是一種可誘導(dǎo)的酶,可被多種壓力誘導(dǎo)。Nfr 2/HO-1信號通路是氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要信號途徑,參與抗炎、抗氧化等[30]。本研究發(fā)現(xiàn),CIH組大鼠肺組織中Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)上調(diào)。

    人參是一種傳統(tǒng)中藥,可能會影響許多生物過程,包括炎癥反應(yīng),細(xì)胞增殖和凋亡。GRg1是人參中含量最豐富的成分,是人參藥理作用的關(guān)鍵成分。有報道,GRg1對活性氧應(yīng)激、衰老、血管生成和神經(jīng)元分化具有調(diào)節(jié)作用[31]。本研究中,GRg1提高了大鼠的肺功能,大鼠肺組織中MDA的含量降低,SOD的活性和GSH的含量升高,TNF-α、IL-1β和IL-6的含量也降低;同時,大鼠肺組織受損減輕,炎性細(xì)胞浸潤減少,大鼠肺組織中COX-2、iNOS、Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)水平下調(diào)。因此,GRg1對OSAHS有一定的治療作用。

    綜上所述,GRg1減弱了COX-2和iNOS的表達(dá)并抑制Nrf2的核易位,從而抑制了下游HO-1基因的轉(zhuǎn)錄并減弱了氧化應(yīng)激反應(yīng),為臨床治療OSAHS提供了新的理論依據(jù)。

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