開封市某場(chǎng)雞源大腸桿菌的分離鑒定與耐藥性分析

史秀玲

（河南省飼草飼料站，河南 鄭州 450008）

近年來(lái)，（埃希氏）大腸桿菌的耐藥性一直在逐漸上升，且已經(jīng)在全世界范圍內(nèi)引起重視。大腸桿菌是一類需氧或微厭氧、革蘭氏染色呈陰性、中等大小的桿狀菌，在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上會(huì)形成黑色金屬光澤的菌落（菌落明顯）。大腸桿菌是一種條件性病原菌（在正常情況下，不會(huì)引起機(jī)體發(fā)病，在機(jī)體的抵抗力變?nèi)鯐r(shí)，此微生物會(huì)大量地繁殖和改變寄生的部位，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體發(fā)?。?，常寄生在人和動(dòng)物的腸道內(nèi)，是一類人畜共患病原菌，其大多數(shù)是腸道內(nèi)的正常菌群，只有少部分是引起病癥的致病性菌群。

大腸桿菌病是一種細(xì)菌性疾病，大腸桿菌是目前使養(yǎng)殖業(yè)受危害最大的致病菌之一。近些年來(lái)，由于養(yǎng)殖戶們對(duì)抗菌藥物不合理的使用和濫用，使得雞體內(nèi)的大腸桿菌耐藥菌株呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì)，這將會(huì)危害我們的公共衛(wèi)生環(huán)境，這種普遍存在的大腸桿菌的耐藥性問(wèn)題與使用抗菌藥物的選擇壓力有關(guān)。

耐藥性的大腸桿菌有兩種：一種是天然存在的耐藥菌，另一種是獲得性耐藥菌。獲得性耐藥菌的穩(wěn)定性及耐藥的種類，因不同的區(qū)域及用藥的使用情況的不同而異，并且其耐藥性可以遺傳給下一代。當(dāng)極少量的耐藥性菌株存在于大量的敏感性菌株中，其危害并不嚴(yán)重，但如果在生產(chǎn)過(guò)程中頻繁使用抗菌藥物，敏感菌的生長(zhǎng)將受到抑制，而耐藥菌株繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖，并最終形成耐藥菌體系。

該研究對(duì)開封的某規(guī)模化養(yǎng)雞場(chǎng)抽取樣品進(jìn)行大腸桿菌分離、鑒定，隨后進(jìn)行耐藥性試驗(yàn)，對(duì)此場(chǎng)雞源大腸桿菌的耐藥情況有了初步認(rèn)識(shí)，為進(jìn)一步防控雞源大腸桿菌病提供了臨床試驗(yàn)資料和理論依據(jù)，同時(shí)也為在臨床上指導(dǎo)養(yǎng)殖戶合理用藥提供了參考。該次耐藥性測(cè)定選用的抗生素涉及10 類16 種，分別是青霉素類（氨芐西林、復(fù)方阿莫西林）、頭孢菌素類（頭孢噻呋、頭孢他啶）、氨基糖苷類（慶大霉素、大觀霉素）、四環(huán)素類（四環(huán)素、多西環(huán)素）、酰胺醇類（氟苯尼考）、磺胺類（磺胺異惡唑、復(fù)方新諾明）、氟喹諾酮類（恩諾沙星、氧氟沙星）、碳青霉烯類（美羅培南）、喹噁啉類（乙酰甲喹）、多粘菌素類（粘桿菌素）。其中乙酰甲喹無(wú)折點(diǎn)值，耐藥率不判定。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來(lái)源 2018 年3 月抽取開封某雞場(chǎng)肛門拭子樣品40個(gè)。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株 大腸埃希氏菌（大腸桿菌）標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25922 購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.3 使用培養(yǎng)基與試劑 革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定板（購(gòu)自BD 公司）；一次性無(wú)菌采樣棒（BPW）（購(gòu)自鄭州君越科萊特健康科技有限公司）；伊紅美藍(lán)瓊脂和營(yíng)養(yǎng)瓊脂（購(gòu)自北京路橋技術(shù)有限公司）。

1.1.4 儀器設(shè)備 細(xì)菌濁度儀，購(gòu)自北京中西遠(yuǎn)大科技公司；全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng)（BD PhoenixTM-100），購(gòu)自BD 公司；低溫可疊放搖床（Thermo MaxQ600），購(gòu)自Thermo公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 采集菌的處理 將一次性無(wú)菌采樣棒（預(yù)增菌）采集的樣品盡快送到實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行36℃±1℃培養(yǎng)16～20 h，設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照。

1.2.2 樣品的分離純化及鑒定 選取預(yù)增菌液1～2環(huán)，劃線于伊紅美蘭瓊脂上，36℃±1℃培養(yǎng)16～20 h，選取單個(gè)菌落（黑色金屬光澤明顯且典型）進(jìn)行劃線純化培養(yǎng)，最后將純化過(guò)的菌落接種于普通的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，同樣條件下進(jìn)行培養(yǎng)，最后采用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。

1.2.3 藥敏試驗(yàn) 選取經(jīng)過(guò)BD鑒定為大腸希埃氏菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂上的菌落，用生理鹽水調(diào)到0.5 MCF，吸取10 μl加入肉湯中混勻，然后分別取100 μl 加入96 孔藥敏板中，36℃±1℃培養(yǎng)16～20 h，最后讀取藥敏試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離結(jié)果

經(jīng)過(guò)預(yù)增菌，大腸埃希氏菌的選擇性培養(yǎng)基的分離純化，以在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基呈黑金屬光澤的為初篩的大腸桿菌，最后經(jīng)全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng)鑒定（BD 鑒定儀），開封此規(guī)?；u場(chǎng)共分離大腸埃希氏菌25 株，總體分離率為62.50%（25/40）。

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

分離的25 株大腸桿菌，對(duì)四環(huán)素、氨芐西林、磺胺異惡唑、恩諾沙星、復(fù)方新諾明、氧氟沙星的耐藥率較高，分別為84.00%、84.00%、100.00%、84.00%、88.00%、88.00%；對(duì)強(qiáng)力霉素（多西環(huán)素）、大觀霉素、氟苯尼考、頭孢噻呋中度耐藥，耐藥率在40.00%～80.00%之間；對(duì)多黏菌素E、頭孢他啶、美羅培南較為敏感，耐藥率均在20.00%以下。具體結(jié)果見表1、圖1。

2.3 多重耐藥結(jié)果

總體來(lái)說(shuō)，分離得到的25株雞源大腸桿菌的多重耐藥嚴(yán)重，多重耐藥率高達(dá)92.00%，主要集中在5耐和7耐，占64.00%，其中7 耐最多，占40.00%。分離到的25 株菌株，對(duì)抗生素的耐藥情況結(jié)果見圖2。

3 討論

該試驗(yàn)從開封某雞場(chǎng)抽取40 個(gè)樣品，分離雞源大腸桿菌25 株，分離菌株的耐藥性結(jié)果比方杰等對(duì)青島地區(qū)雞源大腸桿菌耐藥性檢測(cè)中的氨芐西林（80.90%）要高；比艾偉昌等對(duì)河南省雞源大腸桿菌的分離鑒定與耐藥性分析研究中鄭州地區(qū)的恩諾沙星（63.30%）和氨芐西林（73.30%）要高；比曲志娜等研究不同省區(qū)雞源大腸桿菌耐藥性調(diào)查中河南地區(qū)的慶大霉素（1.00%）、大觀霉素（44.00%）、氨芐西林（46.00%）、四環(huán)素（42.00%）、恩諾沙星（80.00%）和復(fù)方阿莫西林（14.00%）要高。且多重耐藥率已高達(dá)92.00%。由此來(lái)看，開封此場(chǎng)雞源大腸桿菌的耐藥現(xiàn)象較為嚴(yán)重。

在我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的逐步發(fā)展中，抗生素的濫用和無(wú)限制使用，使得雞場(chǎng)的大腸桿菌的發(fā)病率不斷增加，死亡率也是居高不下，大腸桿菌感染已經(jīng)成為目前雞的細(xì)菌性感染的疾病之首。研究表明，不同菌株對(duì)抗菌藥物的敏感性存在差異，在使用抗菌藥物治療時(shí)，需加強(qiáng)對(duì)病原菌耐藥性的檢測(cè)，并對(duì)病原菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，篩選出使病原菌敏感的抗菌藥物，實(shí)現(xiàn)在臨床上的合理規(guī)范用藥，有效減緩細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。在生產(chǎn)過(guò)程中著手搞好衛(wèi)生環(huán)境；加大對(duì)所用器具及禽舍的消毒頻率；注意育雛期的飼養(yǎng)密度及保溫處理；飼料應(yīng)無(wú)糞便污染；營(yíng)養(yǎng)要合理與全面，從而降低菌種的耐藥性。目前，世界上就針對(duì)動(dòng)物源性大腸桿菌對(duì)人用抗菌藥物耐藥性研究的報(bào)道寥寥無(wú)幾，這可能是治療動(dòng)物源性大腸桿菌病的一個(gè)突破口?！?/p>

表1 分離的25株菌對(duì)16種抗生素的具體耐藥情況

圖1 25株雞源大腸桿菌的耐藥結(jié)果

圖2 25株雞源大腸桿菌的多重耐藥結(jié)果