高效液相色譜測定D- 阿洛酮糖3 - 差向異構(gòu)酶酶活力

程嬌梅，齊祥明，郭曉華

（1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266000；2.青島蔚藍生物股份有限公司，山東青島 266000；3.山東美佳集團有限公司，山東 日照 276826）

D- 阿洛酮糖3 - 差向異構(gòu)酶（D-psicose 3-epimerase，DPEase） 是一種酮糖3 - 差向異構(gòu)酶，可以將D- 果糖轉(zhuǎn)化為D- 阿洛酮糖[1]。D - 阿洛酮糖是一種自然界中存在含量極少的稀有糖，其甜度相當于蔗糖的70%，但能量沉積效率僅相當于蔗糖的0.3%（這一數(shù)值明顯低于目前流行的代糖產(chǎn)品，木糖醇），因此D - 阿洛酮糖具有降血糖[2]、影響脂肪代謝[3-4]等生理功能，是一種潛在的可用于控制肥胖和糖尿病[5-6]的新型低熱量甜味劑[7]。目前，如果能實現(xiàn)上述的D- 阿洛酮糖3 - 差向異構(gòu)酶商業(yè)化生產(chǎn)，則有望實現(xiàn)該糖的大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

酶活力是酶制劑生產(chǎn)、應(yīng)用中的關(guān)鍵定量指標。然而，目前關(guān)于D - 阿洛酮糖3 - 差向異構(gòu)酶酶活力測定的方法報道還非常有限。盡管該酶相關(guān)的研究文獻提到了一些酶活力的測定手段[8-10]，但大多語焉不詳，且不夠嚴謹。

因此，嘗試基于該酶產(chǎn)物D - 阿洛酮糖的高效液相色譜定量檢測法的建立，確定該酶活力的檢測方法。D - 阿洛酮糖和D - 果糖為C3 位差向異構(gòu)體，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)相似。因此，在酶活力測定的關(guān)鍵在于通過高效液相色譜將底物D - 果糖和產(chǎn)物D -阿洛酮糖分離，實現(xiàn)對D - 阿洛酮糖含量的精確定量。在此基礎(chǔ)之上，還對該酶的酶促反應(yīng)條件進行了系統(tǒng)的研究，進而建立了操作簡單、準確可靠的酶活力測定方法，為該酶制劑的生產(chǎn)技術(shù)開發(fā)提供酶活力檢測方法上的支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

D - 阿洛酮糖3 - 差向異構(gòu)酶（液體），蔚藍生物集團有限公司提供。

D- 果糖（≥99%）、D- 阿洛酮糖（≥98.0%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供；甲醇、EDTA 二鈉鈣，均為市售色譜純；十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、一水合檸檬酸，均為市售分析純；去離子水，為自制純凈水。

1.2 儀器與設(shè)備

E2695、2414 型高效液相色譜儀，美國沃特世公司產(chǎn)品；PHS-3E 型pH 計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司產(chǎn)品；TG16-WS 型高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品；DK-98-IIA 型恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；QT-1 型漩渦混合器，上海琪特分析儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 分析方法

1.3.1 酶活力定義及酶促反應(yīng)步驟

D- 阿洛酮糖3 - 差向異構(gòu)酶酶活力定義：在一定溫度、pH 值條件下，每分鐘生成1 μmol D- 阿洛酮糖的量定義為一個酶活力單位，用U 表示。

酶促反應(yīng)步驟：取4 mL 一定pH 值、一定質(zhì)量分數(shù)的D- 果糖溶液作為底物，加入1 mL 稀釋好的D- 阿洛酮糖3 - 差向異構(gòu)酶溶液，一定溫度下水浴反應(yīng)一定時間，沸水浴10 min 終止反應(yīng)，冷卻后用高效液相色譜測定D- 阿洛酮糖含量。

D- 阿洛酮糖3 - 差向異構(gòu)酶酶活力計算公式：

式中：U——D- 阿洛酮糖3 - 差向異構(gòu)酶酶活力，U/mL；

C——通過標準曲線算得的D - 阿洛酮糖質(zhì)量濃度，g/L；

0.005 ——反應(yīng)總體積，L；

1 000 000——g 與μg 的轉(zhuǎn)換系數(shù)；

n——稀釋倍數(shù)；

180.16 ——D- 阿洛酮糖摩爾系數(shù)，g/mol；

t——反應(yīng)時間，min；

m——樣品的量，mL。

1.3.2 D - 阿洛酮糖含量測定

色譜條件：色譜柱為Waters Sugar-Pak I 型色譜柱，流動相50 mg/L EDTA 鈣溶液，流速0.3 mL/min，柱溫90 ℃，進樣溫度25 ℃，檢測器為示差檢測器，檢測器溫度35 ℃，進樣量10 μL，運行時間40 min。

在該色譜條件下測定D - 阿洛酮糖含量，對該方法的線性范圍、檢測限、定量限、重復(fù)性、加標收回率進行試驗。

1.3.3 酶活力測定過程中最適條件探索

（1） 底物質(zhì)量分數(shù)的確定。分別用pH 值6.5 的緩沖液配制質(zhì)量分數(shù)為4%，8%，15%，30%，40%的D- 果糖溶液，取4 mL 底物溶液，加入1 mL 酶液（此時的實際底物質(zhì)量分數(shù)為3.2%，6.4%，12.0%，24.0%，32.0%），在45 ℃下進行酶促反應(yīng)30 min，測定反應(yīng)液中的D - 阿洛酮糖產(chǎn)量，以確定底物質(zhì)量分數(shù)是否過量。

（2） 最適反應(yīng)溫度的確定。用pH 值6.5 的緩沖液配制質(zhì)量分數(shù)為30%的D- 果糖溶液，分別在30，35，40，45，50，55，60，65，70 ℃條件下進行酶促反應(yīng)30 min，計算每個溫度下的酶活力，做溫度-酶活力曲線。

（3） 最適反應(yīng)pH 值的確定。分別用pH 值4.0，5.0，6.0，7.0，8.0 的緩沖液配制質(zhì)量分數(shù)為30%的D- 果糖溶液，在45 ℃下進行酶促反應(yīng)30 min，計算每個pH 值下的酶活力，做pH 值- 酶活力曲線。

（4） 反應(yīng)時間的確定。用pH 值7.0 的緩沖液配制質(zhì)量分數(shù)為30%的D- 果糖溶液，在45 ℃下，分別進行5，10，15，20，25，30，60 min 的酶促反應(yīng)，計算不同反應(yīng)時間下的酶活力，做反應(yīng)時間-酶活力曲線。

1.3.4 D - 阿洛酮糖3 - 差向異構(gòu)酶酶活力測定方法驗證

選取10 個不同酶活力的樣品，用pH 值7.0 的緩沖液配制質(zhì)量分數(shù)為30%的D- 果糖溶液，在45 ℃下進行酶促反應(yīng)，計算每個樣品的酶活力，重復(fù)測定5 次，計算其RSD。

2 結(jié)果與分析

2.1 D- 阿洛酮糖HPLC 含量測定

通過前期試驗確定較優(yōu)的色譜條件為Waters Sugar-Pak I 型色譜柱，流動相50 mg/L EDTA 鈣溶液，流速0.3 mL/min，柱溫90 ℃，進樣溫度25 ℃，檢測器為示差檢測器，檢測器溫度35 ℃，進樣量10 μL，運行時間40 min。

果糖與D- 阿洛酮糖色譜圖見圖1。

圖1 果糖與D - 阿洛酮糖色譜圖

由圖1 可知，在此條件下，D- 阿洛酮糖在25～28 min 出峰，和反應(yīng)底物D- 果糖（出峰時間在17.5～21.5 min） 可以實現(xiàn)有效分離。進一步探索可知，D-阿洛酮糖的檢測限為4.12 mg/L；信噪比（S/N）=10 的含量為定量限為10.3 mg/L；在測酶活擬采用的產(chǎn)物質(zhì)量濃度范圍0.5～5.0 g/L 內(nèi)，線性度良好，R2=1。驗證試驗結(jié)果表明，此處建立的該糖檢測方法重復(fù)性（RSD） 小于1.0%；加標回收率為98.92%。

2.2 酶活力測定過程中最適條件探索

底物質(zhì)量分數(shù)- 酶活力測量值關(guān)系見圖2。

圖2 底物質(zhì)量分數(shù)- 酶活力測量值關(guān)系

由圖2 可知，酶反應(yīng)體系中底物質(zhì)量分數(shù)為3.2%～24.0%時，產(chǎn)物D - 阿洛酮糖測量值隨著底物質(zhì)量分數(shù)的增大而增加，這說明此時的底物質(zhì)量分數(shù)沒有達到過量的程度。當?shù)孜顳 - 果糖質(zhì)量分數(shù)超過24.0%時，產(chǎn)物D - 阿洛酮糖測量值不再隨著底物質(zhì)量分數(shù)增加而變化，說明當反應(yīng)體系質(zhì)量分數(shù)超過24.0%時，底物質(zhì)量分數(shù)達到了過量水平。因此，從經(jīng)濟性和酶反應(yīng)的可操作性角度，最終確定反應(yīng)體系內(nèi)底物質(zhì)量分數(shù)為24.0%。底物質(zhì)量分數(shù)再高時，反應(yīng)液黏度大幅度增加，不利于酶反應(yīng)充分進行。酶液酶活過高時，則進行適度的稀釋后再進行測定。

溫度- 酶活力關(guān)系見圖3。

圖3 溫度- 酶活力關(guān)系

由圖3 可知，溫度為30～45 ℃時，酶活力隨溫度增加而增加；45 ℃時，酶活力達到最大值；45～70 ℃時，酶活力隨著溫度增加逐步下降；當溫度為55 ℃時，酶活力只有最高酶活力的40%左右。綜上所述，45 ℃是該酶最適溫度，也是酶活力測定過程中所選用的溫度。

pH 值- 酶活力關(guān)系見圖4。

圖4 pH 值- 酶活力關(guān)系

由圖4 可知，pH 值為4.0～7.0 時，酶活力隨著pH 值的增加而增加；而pH 值為5.5～7.0 時，酶活力增加較快；pH 值7.0 時酶活力測量值達到最大。綜上所述，pH 值7.0 是該酶最適pH 值，也是酶活力測定過程中所選用的pH 值。

反應(yīng)時間- 酶活力測定值關(guān)系見圖5。

圖5 反應(yīng)時間- 酶活力測定值關(guān)系

由圖5 可知，反應(yīng)時間在5～20 min 時，酶活力測定值和反應(yīng)時間呈線性正相關(guān)關(guān)系；反應(yīng)時間為20 min 時，酶活力測定值達到最大；相應(yīng)地，D- 阿洛酮糖質(zhì)量濃度和反應(yīng)時間之間的關(guān)系也近似為線性正相關(guān)。反應(yīng)時間超過20 min 后，體系中D - 阿洛酮糖質(zhì)量濃度趨于穩(wěn)定，此時根據(jù)酶活力計算公式測得的酶活力測定值隨著反應(yīng)時間增加而降低。這表明，在試驗的酶反應(yīng)體系中，當反應(yīng)時間超過20 min 時，酶反應(yīng)達到平衡，此后時間延長將無法正確測得酶活力實際值。因此，為使操作過程時間充足，最終確定D - 阿洛酮糖3 - 差向異構(gòu)酶酶活力測定的反應(yīng)時間為20 min。

2.3 D- 阿洛酮3- 差向異構(gòu)酶酶活力測定方法驗證

在上述確定的酶反應(yīng)條件下，試驗對10 個D -阿洛酮糖3 - 差向異構(gòu)酶樣品進行了酶活力測定試驗，結(jié)果表明，RSD 值均少于5.0%（見表1），符合酶制劑檢測方法建立的要求，證明了高效液相色譜法測定D - 阿洛酮糖3 - 差向異構(gòu)酶酶活力的方法準確可靠。

D- 阿洛酮糖3 - 差向異構(gòu)酶酶活力檢測方法驗證見表1。

表1 D - 阿洛酮糖3 - 差向異構(gòu)酶酶活力檢測方法驗證

3 結(jié)論

采用Waters 高效液相色譜儀（E2695，2414）Waters Sugar-Pak I 型色譜柱測定D- 阿洛酮糖含量，該方法的檢測限為4.12 mg/L，定量限為10.3 mg/L，在測酶活擬選產(chǎn)物質(zhì)量濃度0.5～5.0 g/L 范圍內(nèi)線性度良好（R2=1），重復(fù)性（RSD） 小于1.0%，加標收回率為98.92%。

在高效液相色譜法測定D - 阿洛酮糖含量的基礎(chǔ)上，建立了D - 阿洛酮糖3 - 差向異構(gòu)酶酶活力測定方法，從底物質(zhì)量分數(shù)、溫度、pH 值、反應(yīng)時間等方面考查了這些因素對D- 阿洛酮糖3 - 差向異構(gòu)酶酶活力測定的影響，確定了底物質(zhì)量分數(shù)為24%D- 果糖溶液，最適溫度為45 ℃，最適反應(yīng)pH 值為7.0，反應(yīng)時間為20 min。在該條件下，對D- 阿洛酮糖3- 差向異構(gòu)酶酶活力測定方法進行驗證，10 個樣品的RSD 均少于5.0%，說明高效液相色譜法測定D- 阿洛酮糖3 - 差向異構(gòu)酶酶活力準確可靠。