氧化應(yīng)激對(duì)hKCFs抗氧化酶、炎性因子和基質(zhì)重塑相關(guān)蛋白基因表達(dá)的影響

宋一菲，李曉娜，王思佳，賀 瑞，楊繼忠，吳婷婷

(1.太原理工大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，太原 030024；2.山西省眼科醫(yī)院 a.準(zhǔn)分子激光室，b.角膜病科，太原 030002； 3.山西醫(yī)科大學(xué)附屬晉中醫(yī)院 口腔科，山西 晉中 030600)

圓錐角膜(keratoconus，KC)是一種進(jìn)行性角膜變薄疾病，可引起不規(guī)則散光和視力下降，由遺傳因素[1]和環(huán)境因素(如揉眼、佩帶角膜接觸鏡、紫外線損傷等)[2]多種因素共同造成。

角膜基質(zhì)組織更新代謝的速率較慢，由于長(zhǎng)期暴露在紫外線下，容易受到自由基和活性氧的破壞，引起氧化應(yīng)激水平的升高[3]。研究發(fā)現(xiàn)圓錐角膜患者離體角膜中含有過(guò)氧亞硝酸鹽和丙二醛的生化標(biāo)記物，導(dǎo)致一氧化氮和脂質(zhì)過(guò)氧化的形成[4]。TOPRAK et al[5]發(fā)現(xiàn)，與正常受試者相比，圓錐角膜患者血清總氧化水平及氧化應(yīng)激指標(biāo)顯著升高。氧化應(yīng)激導(dǎo)致圓錐角膜組織退化[6]、基質(zhì)變薄和鮑曼層缺失[7]。此外，超氧化物歧化酶-2(superoxide dismutase-2，SOD-2)、抗氧化酶血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)和 NADPH氧化還原酶(NADPH quinine oxidoreductase-1，NQO-1)3種常見的抗氧化酶，是氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵指標(biāo)，先前的研究發(fā)現(xiàn)，正常人和圓錐角膜患者細(xì)胞中SOD-2、HO-1和NQO-1的表達(dá)不同[8]。

氧化應(yīng)激可引起炎癥，促進(jìn)炎性因子的釋放，參與動(dòng)脈粥樣硬化和肺損傷等疾病的發(fā)生發(fā)展[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)圓錐角膜患者淚液中存在腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)、白介素(interleukin，IL)-1/-4/-5/-6/-8/-17等炎性因子，表明圓錐角膜的發(fā)生發(fā)展與慢性炎癥密切相關(guān)[11-12]。組織損傷后，適當(dāng)?shù)难装Y反應(yīng)能夠促進(jìn)組織修復(fù)，但炎性因子多度或長(zhǎng)期存在則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、壞死和纖維化，最終造成組織結(jié)構(gòu)破壞和功能衰退[13]。目前圓錐角膜中的炎性因子的來(lái)源尚不清楚。

本文通過(guò)對(duì)圓錐角膜患者角膜成纖維細(xì)胞添加過(guò)氧化氫，探討了氧化應(yīng)激對(duì)HO-1、SOD-2、NQO-1、炎性因子(ICAM-1、IL-1β/-6/-8)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-1/-3、Ⅰ型膠原-α2(Collagen Ⅰ-α2)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)-1/-2/-3、賴氨酰氧化酶樣蛋白(lysyl oxidase like，LOXL)-1/-3/-4基因表達(dá)的影響，以及氧化應(yīng)激在圓錐角膜發(fā)病中的作用，這將有助于更好地理解圓錐角膜發(fā)病機(jī)制，為臨床圓錐角膜的診治提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 主要試劑

成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基(Gibico，美國(guó))、胰蛋白酶(Gibico，美國(guó))、Ⅱ型膠原酶(Sigma，美國(guó))、過(guò)氧化氫(上海碧云天)、TRIZOL及 Prime-ScriptTMRT reagent Kit 檢測(cè)試劑(Takara，大連)、2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)(Sigma，美國(guó))。

1.2 人角膜成纖維細(xì)胞的提取及培養(yǎng)

兩例圓錐角膜患者角膜組織取自山西省眼科醫(yī)院，均為角膜移植術(shù)后廢棄的病理組織。機(jī)械剝離角膜上皮和內(nèi)皮層，磷酸緩沖鹽溶液反復(fù)清洗后，用含 1 mg/mL Ⅱ型膠原酶的培養(yǎng)基消化，直至組織塊完全消失，鏡下可見單個(gè)細(xì)胞時(shí)終止消化。2 000 r/min離心5 min，棄上清，加入成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)為2%胎牛血清、1%體積分?jǐn)?shù)為青/鏈霉素、1%體積分?jǐn)?shù)為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)，并置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，本實(shí)驗(yàn)采用2～4代的細(xì)胞。

1.3 過(guò)氧化氫處理

采用濃度為100 μmol/L過(guò)氧化氫處理細(xì)胞4 h，以未做任何處理的細(xì)胞作為對(duì)照。處理結(jié)束后，磷酸緩沖鹽溶液清洗，分別用TRIZOL裂解細(xì)胞，收集RNA.

1.4 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)抗氧化酶基因表達(dá)

收集細(xì)胞裂解液，提取總RNA，使用Prime-ScriptTMRT reagent Kit試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA.采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR(StepOne Plus，ABI，美國(guó))檢測(cè)SOD-2、HO-1、NQO-1、IL-1β/-6/-8、ICAM-1、MMP-1/-3、TIMP-1/-2/-3、Collagen I -α2、 LOXL-1/-3/-4 mRNA表達(dá)，并以管家基因GAPDH作為內(nèi)參。人目標(biāo)基因引物序列見表1.PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，1個(gè)循環(huán)；95 ℃變性5 s，60 ℃退火、延伸30 s，35個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT法對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量分析。

表1 人目標(biāo)基因引物序列Table 1 Human target gene primer sequence

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)分析。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 氧化應(yīng)激對(duì)角膜成纖維細(xì)胞抗氧化酶基因表達(dá)的影響

氧化應(yīng)激可顯著上調(diào)KC細(xì)胞中抗氧化酶基因表達(dá)，如圖1所示，與未處理組相比，氧化應(yīng)激條件下KC1和KC2細(xì)胞HO-1基因表達(dá)水平均升高，相對(duì)表達(dá)量分別是對(duì)照組的2.1和1.88倍(P<0.05)；NQO-1基因表達(dá)水平也均升高，KC1和KC2細(xì)胞中NQO-1相對(duì)表達(dá)量分別是對(duì)照組的1.37和1.32倍(P<0.05)；SOD-2基因表達(dá)與前兩者相似，分別是對(duì)照組的1.86和1.92倍(P<0.05).

*P<0.05，與各自對(duì)照組比較圖1 過(guò)氧化氫對(duì)圓錐角膜成纖維細(xì)胞抗氧化酶基因表達(dá)的影響Fig.1 Effects of H2O2 on the gene expression of antioxidant enzymes in hKCFs

2.2 氧化應(yīng)激對(duì)角膜成纖維細(xì)胞炎性因子基因表達(dá)的影響

如圖2所示，與未處理組相比，氧化應(yīng)激使KC1和KC2細(xì)胞中IL-1β基因表達(dá)顯著升高，分別為對(duì)照組的16.57和7.56倍(均P<0.05)；IL-6、IL-8基因表達(dá)與IL-1β類似，IL-6表達(dá)分別為對(duì)照組的7.51和3.34倍(均P<0.05)；IL-8表達(dá)分別為對(duì)照組的3.72和1.45倍(均P<0.05)；ICAM-1基因表達(dá)不同，KC1細(xì)胞ICAM-1基因表達(dá)為對(duì)照組的1.83倍(均P<0.05)，KC2細(xì)胞則無(wú)顯著變化(P>0.05).

2.3 氧化應(yīng)激對(duì)圓錐角膜成纖維細(xì)胞MMPs和TIMPs基因表達(dá)的影響

如圖3所示，氧化應(yīng)激條件下，KC1和KC2細(xì)胞MMP3基因表達(dá)均高于對(duì)照組，分別為對(duì)照組的1.86和1.92倍(均P<0.05)；KC1細(xì)胞MMP-1基因表達(dá)高于對(duì)照組細(xì)胞，為對(duì)照組的1.32倍(P<0.05)；而KC2細(xì)胞無(wú)顯著變化(P>0.05)；MMP-2基因表達(dá)二者均無(wú)顯著變化。

*表示P<0.05，與各自對(duì)照組比較圖2 過(guò)氧化氫對(duì)圓錐角膜成纖維細(xì)胞炎性因子基因表達(dá)的影響Fig.2 Effects of H2O2 on the gene expression of inflammatory cytokines in hKCFs

氧化應(yīng)激使KC1、KC2細(xì)胞TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3基因表達(dá)均顯著下調(diào)。與各自的空白對(duì)照組比較，TIMP-1分別降低了14%和15%(均P<0.05)；TIMP-2分別降低了12%(P<0.05)和6%(P>0.05)；TIMP-3分別降低了33%和11%(均P<0.05).

2.4 氧化應(yīng)激對(duì)角膜成纖維細(xì)胞Collagen Ⅰ和LOXLs基因表達(dá)的影響

如圖4所示，與未處理組相比，氧化應(yīng)激使KC1和KC2細(xì)胞CollagenⅠ-α2基因表達(dá)均下調(diào)，與對(duì)照組相比，分別降低了10%和26%(均P<0.05)；LOXL-4和LOXL-1表達(dá)與CollagenⅠ-α2相似，與對(duì)照組相比，LOXL-1分別降低了43%和16%(均P<0.05)，LOXL-4分別降低了47%和33%(均P<0.05)；LOXL-3表達(dá)略有不同，KC1細(xì)胞下降了14%(P<0.05)，而KC2細(xì)胞上調(diào)了11%(P>0.05).

3 討論

氧化應(yīng)激和抗氧化的平衡調(diào)節(jié)是抵御多種疾病和人體進(jìn)行自我保護(hù)的重要途徑，參與內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)以及維持人體正常生理功能的調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)圓錐角膜患者角膜細(xì)胞、角膜組織甚至整個(gè)機(jī)體內(nèi)ROS水平均偏高，導(dǎo)致角膜處于氧化應(yīng)激狀態(tài)[4-7]。目前氧化應(yīng)激在圓錐角膜中的作用尚不清楚。本文主要探索了氧化應(yīng)激對(duì)圓錐角膜成纖維細(xì)胞、炎性因子及基質(zhì)重塑相關(guān)基因表達(dá)的影響。

當(dāng)機(jī)體持續(xù)產(chǎn)生自由基時(shí)，抗氧化酶促防御系統(tǒng)被激活，通過(guò)降低活性氧水平，維持體內(nèi)氧化與抗氧化動(dòng)態(tài)平衡，從而防止細(xì)胞發(fā)生氧化損傷[14]。關(guān)于圓錐角膜細(xì)胞抗氧化酶表達(dá)的報(bào)道并不一致。邊江等[15]研究發(fā)現(xiàn)，圓錐角膜成纖維細(xì)胞中抗氧化酶SOD2、HO-1、NQO-1的表達(dá)較正常人顯著下降，過(guò)氧化氫處理后表達(dá)量未見明顯變化；筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，與正常人相比，部分圓錐角膜成纖維細(xì)胞的HO-1和NQO-1顯著降低，而部分圓錐角膜成纖維細(xì)胞HO-1和SOD2則顯著增高，機(jī)械牽拉可引起ROS升高，但不同圓錐角膜患者抗氧化酶表達(dá)不同[8]。ATILANO et al[16]發(fā)現(xiàn)圓錐角膜成纖維細(xì)胞SOD1表達(dá)下降，而SOD2表達(dá)上升。本文研究發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化氫可使圓錐角膜成纖維細(xì)胞SOD2、HO-1和NQO-1表達(dá)均增加。說(shuō)明部分圓錐角膜患者發(fā)病與抗氧化系統(tǒng)活化缺陷有關(guān)，而部分患者抗氧化酶系統(tǒng)工作正常，但ROS/RNS清除機(jī)制障礙，亦可引起細(xì)胞損傷。報(bào)道的結(jié)果差異與患者病程和病因不同以及樣本量有關(guān)，同時(shí)也提示了圓錐角膜發(fā)病機(jī)制的多樣性和復(fù)雜性。

*表示P<0.05，與各自對(duì)照組比較圖3 過(guò)氧化氫對(duì)圓錐角膜成纖維細(xì)胞MMPs和TIMPs基因表達(dá)的影響Fig.3 Effects of H2O2 on the gene expression of MMPs and TIMPs in hKCFs

*表示P<0.05，與各自對(duì)照組比較圖4 過(guò)氧化氫對(duì)圓錐角膜成纖維細(xì)胞Collagen Ⅰ和LOXLs基因表達(dá)的影響Fig.4 Effects of H2O2 on the gene expression of Collagen Ⅰ and LOXLs in hKCFs

研究顯示圓錐角膜患者淚液和角膜細(xì)胞和組織中的IL-1/-6/-8、TNF-α、ICAM-1等炎癥相關(guān)因子表達(dá)明顯高于正常人，提示圓錐角膜與慢性炎癥密切相關(guān)[17]。本文研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)氧化氫處理后圓錐角膜成纖維細(xì)胞炎性因子IL-1β/-6/-8和ICAM-1基因表達(dá)顯著上調(diào)。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下角膜上皮細(xì)胞也會(huì)釋放IL-6[7].提示氧化應(yīng)激可能是圓錐角膜炎性因子高表達(dá)的重要來(lái)源。

氧化應(yīng)激導(dǎo)致組織降解。氧化應(yīng)激可通過(guò)上調(diào)MMP-1、MMP-2、MMP-3及MMP-7的表達(dá)，參與皮膚損傷及結(jié)直腸癌等疾病的發(fā)展[18-19]，還可以通過(guò)調(diào)節(jié)MMPs/TIMPs參與動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激可顯著上調(diào)圓錐角膜成纖維細(xì)胞中MMP-1/-3的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)TIMP-1/-2/-3的表達(dá)。BROWN et al[6]發(fā)現(xiàn)過(guò)亞硝酸鹽或一氧化氮可降低人角膜成纖維細(xì)胞TIMP-1同時(shí)增加明膠酶活性，提示氧化應(yīng)激與角膜組織之間降解存在一定關(guān)聯(lián)。前期研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α和IL-6可促進(jìn)圓錐角膜成纖維細(xì)胞MMP-1的表達(dá)，IL-6抗體可明顯抑制TNF-α誘導(dǎo)的MMP-1升高[21]；抑制IL-1可下調(diào)MMP-1/-3/-13表達(dá)，促進(jìn)軟骨修復(fù)[22]。說(shuō)明炎性因子通過(guò)干擾基質(zhì)金屬蛋白酶與其抑制因子表達(dá)之間的平衡，參與了組織損傷修復(fù)和疾病病理過(guò)程。

Ⅰ型膠原是構(gòu)成角膜基質(zhì)的主要膠原蛋白，可通過(guò)LOXs交聯(lián)形成穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)角膜組織力學(xué)特性和抗蛋白水解酶降解能力。前期研究發(fā)現(xiàn)，圓錐角膜患者角膜成纖維細(xì)胞中LOX和LOXLs基因表達(dá)均明顯低于正常人[23]。本研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激可顯著降低圓錐角膜細(xì)胞Collagen Ⅰ-α2、LOXL-1/-3/-4的表達(dá)，這將導(dǎo)致角膜組織結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性下降。

本研究也存在一定的局限性。由于圓錐角膜發(fā)病的復(fù)雜性導(dǎo)致患者個(gè)體差異較大，大樣本量可使研究結(jié)果更具參考價(jià)值，因此本文結(jié)果的解釋還需謹(jǐn)慎。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激狀態(tài)下，圓錐角膜成纖維細(xì)胞炎性因子表達(dá)增加，促進(jìn)了MMPs與TIMPs表達(dá)失衡，LOXLs表達(dá)降低，導(dǎo)致Ⅰ型膠原降解增加，交聯(lián)障礙。這不僅破壞了角膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，而且使角膜組織抵抗非特異性蛋白水解酶能力下降，進(jìn)而導(dǎo)致力學(xué)性能下降，加速角膜擴(kuò)張。因此，避免圓錐角膜處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，有效控制炎性因子的釋放，有望減緩圓錐角膜的發(fā)展進(jìn)程。