微量苯酚降解中間體LLE-HPLC檢測條件優(yōu)化

暢彤,崔建國,張峰

(1.太原理工大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030600；2.山西省市政工程研究生教育創(chuàng)新中心，山西 晉中 030600)

酚類微污染水應(yīng)急處理是一種亟待解決的環(huán)境與健康問題[1]。微污染水處理過程中，苯酚降解產(chǎn)生的主要中間體對苯二酚和對苯醌的毒性危害是關(guān)注的焦點[2]。

目前，有機微污染原水采用高錳酸鉀+活性炭工藝處理[3]，降解過程有毒中間體較多，因此研究用高鐵酸鉀替代[4-5]。進廠原水中揮發(fā)酚(以苯酚計)的濃度應(yīng)低于2 μg/L[6]。污染物的低濃度和高鐵酸鉀降解苯酚的高效性[7]，使得殘留污染濃度很低,現(xiàn)有檢測方法很難達到檢測要求[8-9]。

液液萃取-高效液相色譜聯(lián)用(LLE-HPLC)操作簡便，較為經(jīng)濟[10]，其中液液鹽析簡單快速、高倍富集[11-12],但局限較大[13]，必須優(yōu)化條件提高精度。本文以微量苯酚及對苯二酚和對苯醌檢測為例，研究優(yōu)化條件，以期檢測精度雙優(yōu)。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

無水苯酚、對苯二酚、對苯醌、高鐵酸鉀、氨水(25%)、硫酸、無水硫酸鈉、硫酸銨、乙酸乙酯、冰乙酸等均為分析純;乙腈、甲醇為色譜純，由Millipore Milli-Q超純水系統(tǒng)配制所需溶液。

LC-100 液相色譜儀；色譜柱(5 μm×4.6 mm×250 mm)；DHG-9070B電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；FE28 pH計；LD-4臺式離心機；50 mL離心管；THZ-82B數(shù)顯恒溫振蕩器；DCY-SY12型水浴氮吹儀；STP FA2004天平；JY 0002電子天平；1 mL微量注射器等。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.2.1 液相色譜檢測條件實驗溶液 使用色譜甲醇及色譜乙腈分別配制苯酚、對苯二酚、對苯醌均為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，4 ℃避光保存，當(dāng)天檢測。使用前用色譜級甲醇或色譜級乙腈逐級稀釋到0.1 mg/L，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 萃取條件實驗溶液 使用超純水配制苯酚、對苯二酚、對苯醌、順丁烯二酸、丁二酸、草酸均為1 000 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，4 ℃避光保存，當(dāng)天檢測。使用前，用超純水逐級稀釋到2 μg/L，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 實驗方法

1.3.1 液相色譜條件 波長260 mm，流速0.8 mL/min， 柱溫30 ℃，進樣量20.0 μL。采用色譜峰的保留時間定性，外標(biāo)法峰高定量。流動相為甲醇∶水=40∶60。

1.3.2 萃取方法 取24 mL稀釋至2 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液放入50 mL離心管中，加入13.0 g硫酸銨，用移液槍精準(zhǔn)量取并加入400 μL 萃取劑，振蕩使硫酸銨溶解。置于振蕩器中以200 r/min速率振蕩萃取15 min。取出,放在離心機中,以1 500 r/min離心5 min。取出,置于試管架上,用1 mL微量注射器反復(fù)取樣,直到無法觀測到兩相分層。將萃取溶液經(jīng)過無水硫酸鈉吸水后置于2 mL進樣瓶中，使用后的無水乙酸鈉用少量萃取劑沖洗,將沖洗液一并置于進樣瓶中。若使用乙酸乙酯作為萃取劑，還應(yīng)在置于進樣瓶后使用小流量氮氣氮吹進樣瓶中液體,使乙酸乙酯濃縮到0.1 mL左右，再以1 mL色譜甲醇沖洗瓶壁，再次氮吹濃縮至液體0.1 mL后，用色譜甲醇將液體定容至1 mL。以微量注射器吸取瓶中液體檢測。每組實驗平行檢測3次，取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取條件優(yōu)化

2.1.1 萃取劑選擇 目前，液液萃取法提取多種酚類化合物的方法中，主要采用的萃取劑種類有二氯甲烷、乙酸乙酯、異丙醇、正辛醇等[14-15]，本文考察了二氯甲烷、乙酸乙酯、異丙醇、正辛醇對苯酚及其降解產(chǎn)物的富集作用和回收率，結(jié)果見表1。

表1 萃取劑富集倍數(shù)

由表1可知，二氯甲烷對苯酚萃取效果較差，且回收率明顯不如乙酸乙酯，同時二氯甲烷毒性大，不如乙酸乙酯安全環(huán)保。異丙醇富集倍數(shù)能達到大約75.0倍，但是對苯酚及對苯醌的富集因子較乙酸乙酯仍有差距，且對苯酚開環(huán)羧酸產(chǎn)物萃取效果不如乙酸乙酯。根據(jù)范云場等的研究[16]，正辛醇對苯酚及對苯二酚的富集效果較為穩(wěn)定。實驗結(jié)果表明，正辛醇對降解產(chǎn)物的富集倍數(shù)不能滿足實驗需求。綜合考慮，最終選用可以通過氮吹進一步濃縮來提高富集倍數(shù)的乙酸乙酯作為萃取劑。

圖1 硫酸銨、氯化銨質(zhì)量對回收率的影響

由圖1可知，硫酸銨的鹽析效果優(yōu)于氯化銨，故選擇硫酸銨作為鹽析效應(yīng)中添加的鹽種類。隨著硫酸銨質(zhì)量增加，溶劑與各物質(zhì)回收率逐漸增加，其中苯酚回收率穩(wěn)步上升，對苯二酚、對苯醌回收率低于苯酚，這主要是因為二者在水中溶解度大于苯酚，有部分物質(zhì)未被萃取所致。但是硫酸銨繼續(xù)增加時，卻出現(xiàn)了對苯二酚和對苯醌回收率反而下降的情況，猜測是由于水中離子濃度過高反而影響到了乙酸乙酯對這2種物質(zhì)在乙酸乙酯-水體系中的重分配[20]。同時乙酸乙酯回收率也在增加，這主要是因為鹽溶于水，改變了水樣極性，從而使乙酸乙酯更容易與水樣分離[21]。實驗結(jié)果表明，投加13 g硫酸銨的時候，可以得到對3種物質(zhì)的最優(yōu)富集效果。

2.1.3 萃取時間確定 考察了萃取時間對苯酚、對苯二酚和對苯醌3種產(chǎn)物及乙酸乙酯萃取劑的回收率，結(jié)果見圖2。

圖2 萃取時間對回收率的影響

由圖2可知，硫酸銨13.0 g萃取時間取20 min左右時，對苯酚等3種待測物質(zhì)能基本達到最優(yōu)萃取效率，時間繼續(xù)增長對萃取結(jié)果影響不大。20 min 后，對苯二酚回收率下降，猜測是因為萃取過程與空氣接觸，產(chǎn)生氧化的原因。故萃取時間選擇20 min。

2.2 HPLC分析條件優(yōu)化

2.2.1 波長選擇 經(jīng)過對標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的最大吸收波長掃描，可知苯酚及其降解產(chǎn)物最大吸收波長在180～280 mm范圍內(nèi)。在波長為260 mm的情況下，可以使幾種物質(zhì)得到較好的分離，拖尾減弱，峰型良好。

2.2.2 流動相選擇 一些測定苯酚降解產(chǎn)物的實驗中采用乙腈-水體系作為流動相[22-23]。實驗結(jié)果表明，在同樣物質(zhì)濃度的情況下，使用乙腈-水流動相體系雖然在物質(zhì)保留時間和拖尾因子上比甲醇-水流動相體系更有優(yōu)勢，但是考慮到出峰總用時及待測物質(zhì)響應(yīng)值大小程度，甲醇-水體系無疑是更優(yōu)選擇。在實際情況下能夠更好體現(xiàn)幾種有毒降解中間體。

在一些多種苯系物同時HPLC測定的情況下，在采用甲醇-水流動相體系的同時在流動相純水組分中添加1%的冰乙酸或甲酸[24-25]。因為苯酚、苯二酚的酚羥基會在純水中電離，從而在C18色譜柱上造成色譜峰拖尾的現(xiàn)象[26]。同時需要注意的是，因為實驗中采用的是純甲醇作為溶劑，出峰中還存在溶劑峰，所以在出峰情況不佳的情況下很難判斷物質(zhì)峰歸屬。實驗發(fā)現(xiàn)，添加冰乙酸雖然利于部分待測物以分子形式存在，抑制酚類電離，但是對苯酚降解開環(huán)后羧酸產(chǎn)物的峰型及峰值存在一定影響，在保留時間接近的情況下反而會出現(xiàn)羧酸產(chǎn)物拖尾蓋住對苯二酚的情況，實際能測出的物質(zhì)峰只有3個，故不選擇。由此可知，選用甲醇-水體系作為流動相是比較合適的。

2.2.3 流動相優(yōu)化 實驗中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)流動相中甲醇組分占比升高的時候，待測化合物的保留時間不斷縮短，同時拖尾因子也比較小，峰型對稱，出峰情況良好。但是，因為保留時間接近，導(dǎo)致物質(zhì)與物質(zhì)峰之間出現(xiàn)疊合，造成無法判斷物質(zhì)種類及其定量問題。所以，在綜合考慮出峰情況、出峰總時長之后，在苯酚、對苯二酚、對苯醌均為0.1 mg/L的條件下完成了甲醇∶水不同比例的響應(yīng)值實驗，結(jié)果見表2。

表2 甲醇/水體系流動相苯酚及中間體響應(yīng)值

由表2可知，隨著甲醇在流動相中組分比例減少，3種待測物質(zhì)峰高均有降低，這是因為甲醇組分的減少,降低了3種物質(zhì)的洗脫度，加重拖尾現(xiàn)象。甲醇∶水=50∶50時,由于草酸和其他物質(zhì)峰過于接近，不利于對幾種苯環(huán)開環(huán)后羧酸類物質(zhì)的測定，考慮對草酸和順丁烯二酸的測定需求，選擇甲醇∶水=40∶60作為流動相。在流速為0.8 mL/min，波長為260 mm的條件下,可以實現(xiàn)對幾種待測物質(zhì)的有效分離,且因保留時間靠前,所需總時長較短，客觀上提高了測定效率。對主要檢測物質(zhì)苯酚、對苯二酚和對苯醌都有較為良好的檢測效果。

2.2.4 標(biāo)線測定 以色譜甲醇分五級逐級稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備液至0.05～10.0 mg/L，得到苯酚、對苯二酚、對苯醌3個待測物標(biāo)準(zhǔn)溶液，以各化合物峰高作為考量依據(jù)，進行線性回歸分析，結(jié)果見表3。

表3 化合物線性參數(shù)

2.3 檢測精確度分析

實驗結(jié)果表明，苯酚、對苯二酚和對苯醌的富集倍數(shù)可達到75.0,72.7,69.1倍。做不同濃度富集實驗，以富集后實際檢測值去除富集倍數(shù)，得到相對誤差，結(jié)果見表4。

表4 檢測分析誤差

由表4可知，本實驗相對誤差在可接受范圍內(nèi)，3種物質(zhì)分析精確度較高。

2.4 實例檢測分析

分別在苯酚初始濃度為0.01,0.1,1 mg/L的情況下，以高鐵酸鉀與苯酚質(zhì)量比為20∶1，進行高鐵酸鉀降解苯酚的實驗，初始pH為9，反應(yīng)時間為30 min， 反應(yīng)溫度為25 ℃。乙酸乙酯萃取，硫酸銨投加13 g，萃取時間20 min，液相色譜檢測條件波長260 nm，流動相為甲醇∶水=40∶60,結(jié)果見表5。

表5 實際檢測效果

由表5可知，苯酚初始濃度在0.1 mg/L以上時，檢測效果良好，但是初始濃度為0.01 mg/L時，由于反應(yīng)產(chǎn)生的對苯二酚和對苯醌兩種中間體過少，超出檢測范圍,無法準(zhǔn)確檢測，但是此時已足以說明苯酚降解后幾種毒性強烈物質(zhì)總量處于規(guī)范要求標(biāo)準(zhǔn)線下，滿足給水廠水源水進廠要求。

3 結(jié)論

(1)未經(jīng)過萃取的水樣直接檢測,雜峰多,不能滿足高鐵酸鹽降解苯酚過程中微量殘留苯酚、對苯二酚、對苯醌等有毒有害中間體檢測的要求，通過氮吹濃縮的乙酸乙酯萃取是十分有效的液液萃取方法。

(2)HPLC色譜優(yōu)化條件為波長260 nm，流動相為甲醇∶水=40∶60時，可有效消除物質(zhì)峰不顯示或重疊不能分離的情況，檢測的殘留苯酚、對苯二酚、對苯醌的物質(zhì)峰分離明顯，基本滿足實驗中對幾種有毒有害物質(zhì)的檢測要求。

(3)鹽析微萃取-液相色譜法聯(lián)用法在合適的萃取和色譜條件下,可完成對苯酚等幾種主要檢測物質(zhì)的富集檢測，且實驗精確度較高，是一種簡易可靠的微量苯酚及其中間體濃度檢測方法。