雙水相萃取法提取地骨皮多酚及抗氧化活性研究

臧慧靜，劉學(xué)，孫亞娟，楊成

(江南大學(xué) 化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

地骨皮為茄科植物枸杞(LyciumchinenseMill.)或?qū)幭蔫坭?LyciumbarbarumL.)干燥的根皮，可涼血除蒸，清肺降火，用于陰虛潮熱，骨蒸盜汗，肺熱咳嗽，內(nèi)熱消渴等[1]。國(guó)內(nèi)外的研究表明，其富含的多酚類物質(zhì)[2-4]，如綠原酸、阿魏酸和大黃素等物質(zhì)易溶于乙醇等有機(jī)溶劑中，具有一定的抗氧化活性[5-7]。

常見的地骨皮提取技術(shù)包括回流提取法[8]、表面活性劑輔助超聲波法[9]、微波法[10]、超臨界流體法等[11]，但這些方法存在或部分存在能耗大、易污染環(huán)境或設(shè)備要求高等問題。雙水相萃取技術(shù)具有設(shè)備要求簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和且耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于天然產(chǎn)物分離領(lǐng)域[12-14]。本文以乙醇/硫酸銨雙水相體系提取地骨皮多酚(LCPPs)，并對(duì)LCPPs的抗氧化活性進(jìn)行初步的研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

地骨皮，購(gòu)自無錫市民大藥房，產(chǎn)自甘肅，經(jīng)鑒定為枸杞(LyciumchinenseMill.)的干燥根皮，粉碎后過60目篩，密封避光保存；人皮膚成纖維細(xì)胞(HSF 細(xì)胞)，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；抗壞血酸(VC)、硫酸銨、無水乙醇、過硫酸鉀、2,2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)、2，2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽(AAPH)、熒光素鈉(FL)、奎諾二甲基丙烯酸酯(Trolox)等均為分析純;DMEM 培養(yǎng)液、青霉素-鏈霉素雙抗、磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、胰蛋白酶溶液為美國(guó) Hyclone 公司；CCK-8試劑盒、CuZn/Mn-SOD活性檢測(cè)試劑盒(WST-8法)、GSH和GSSG檢測(cè)試劑盒來自碧云天生物技術(shù)研究所。

Synergy H4多功能酶標(biāo)儀；Infinite M200 PRO紫外酶標(biāo)儀；Olympus Ckx41倒置生物顯微鏡；SB-5200 DTD超聲波清洗機(jī)；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)；Centrifuge 5804 R離心機(jī)；3111培養(yǎng)箱; RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。

1.2 LCPPs提取

稱取地骨皮粉末1 g，置于錐形瓶中，分別加入硫酸銨和乙醇水溶液，在35 ℃下超聲波輔助提取30 min。 抽濾，濾液靜置分層,分別取上下相溶液，密封儲(chǔ)存。以福林酚法測(cè)定多酚含量[15]。精密吸取100 μL一定濃度的樣品/沒食子酸溶液(質(zhì)量濃度為50～500 mg/L)于比色管中，依次加入200 μL福林酚溶液和800 μL去離子水，混勻后避光反應(yīng)6 min。 加入2 mL 7%碳酸鈉溶液，以去離子水定容至5 mL，搖勻，室溫下避光放置90 min后，于760 nm 處測(cè)定吸光度。以沒食子酸質(zhì)量濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.008 5x+0.051 2，R2=0.998 9)。多酚得率和總多酚得率按照以下公式計(jì)算：

多酚得率=ρ上×V上/m

總多酚得率=(ρ上×V上+ρ下×V下)/m

式中ρ上——上相地骨皮多酚的沒食子酸當(dāng)量濃度，mg/L；

ρ下——下相地骨皮多酚的沒食子酸當(dāng)量濃度，mg/L；

V上——雙水相體系上相體積，L；

V下——雙水相體系下相體積，L；

m——地骨皮生料質(zhì)量，g。

1.3 抗氧化活性

1.3.1 DPPH·清除率測(cè)定[16]96孔板中分別加入0.1 mL樣品溶液和0.1 mL 0.2 mmol/L DPPH 乙醇溶液，室溫下避光反應(yīng)30 min，于517 nm處測(cè)定吸光度。以0.1 mL樣品溶劑代替待測(cè)液作為對(duì)照組，以乙醇代替DPPH溶液作為空白組。按照以下公式計(jì)算清除率：

清除率%=[1-(As-Ab)/Ac]×100

式中As為樣品組吸光度；Ab空白組吸光度；Ac為對(duì)照組吸光度。

1.3.2 ABTS·清除率測(cè)定[17-18]將7 mmol/L ABTS溶液(含2.45 mmol/L過硫酸鉀)常溫避光放置16 h后，以水稀釋至吸光度為(0.7±0.02)(734 nm)。

在96孔板中依次加入10 μL樣品與190 μL ABTS·溶液，15 min后于734 nm處測(cè)定吸光度。按照以下公式計(jì)算清除率：

清除率%=(1-As/0.7)×100

式中,As為樣品組吸光度。

1.3.3 抗氧化能力指數(shù)測(cè)定(ORAC) 黑色96孔板中依次加入25 μL樣品或樣品溶劑，25 μL 504 nmol/L FL溶液，37 ℃保溫15 min。加入17 mmol/L 150 μL AAPH溶液，在發(fā)射波長(zhǎng)535 nm、 激發(fā)波長(zhǎng)485 nm下每2 min測(cè)定一次熒光強(qiáng)度，檢測(cè)90 min。參考續(xù)潔琨等[19]的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.3.4 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞內(nèi)總谷胱甘肽含量和SOD活性[20]HSF細(xì)胞稀釋濃度為1×106個(gè)/mL后接種于孔板中。培養(yǎng)24 h后用700 μmol/L H2O2處理1 h，移去溶液，PBS洗2次，加入2 mL DMEM溶解的樣品，培養(yǎng)箱孵育1 h。移去培養(yǎng)液，PBS洗2次；空白對(duì)照組未經(jīng)過H2O2處理且未添加樣品，H2O2模型組經(jīng)過H2O2處理且未添加樣品。按照試劑盒要求檢測(cè)細(xì)胞的存活率、總谷胱甘肽含量和SOD活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

選取乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、硫酸銨添加量、料液比、超聲時(shí)間和溫度5個(gè)影響因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化提取工藝。

2.1.1 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)LCPPs得率的影響 稱取1 g地骨皮粉末，置于錐形瓶中，分別加入25 g質(zhì)量分?jǐn)?shù)為32%,35%,38%,41%,44%,46%的乙醇溶液，與乙醇溶液的質(zhì)量比為25∶100的硫酸銨，在35 ℃ 下超聲波輔助提取30 min，結(jié)果見圖1。

圖1 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)LCPPs得率的影響

由圖1可知，隨著乙醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，LCPPs的總得率和上相得率逐漸升高，同時(shí)85%以上的LCPPs集中在乙醇含量較高的上相[21],原因主要為此類物質(zhì)更容易溶解于乙醇中。為降低樣品溶劑處理量，提高生產(chǎn)效率，僅選取上相進(jìn)行研究,并選擇乙醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為41%。

2.1.2 硫酸銨與乙醇溶液質(zhì)量比對(duì)LCPPs得率的影響 稱取1 g地骨皮粉末，置于錐形瓶中，加入25 g 41%乙醇溶液，分別加入與乙醇溶液的質(zhì)量比為9∶100, 11∶100,13∶100,15∶100,17∶100,19∶100,21∶100 和25∶100的硫酸銨，在35 ℃下超聲波輔助提取30 min，結(jié)果見圖2。

圖2 硫酸銨與乙醇溶液質(zhì)量比對(duì)LCPPs得率的影響

由圖2可知，當(dāng)硫酸銨與乙醇溶液質(zhì)量比增加時(shí)，LCPPs得率隨著硫酸銨相對(duì)質(zhì)量的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)二者質(zhì)量比為13∶100時(shí)，LCPPs得率最高。其主要原因推測(cè)為隨著硫酸銨的增加，下相體積不斷增大，雖然經(jīng)檢測(cè)上相中多酚類物質(zhì)的濃度有所增加，但上相體積明顯減少，最終影響了上相的多酚得率。故實(shí)驗(yàn)選擇二者質(zhì)量比為13∶100。

2.1.3 地骨皮與乙醇溶液質(zhì)量比對(duì)LCPPs得率的影響 稱取1 g地骨皮粉末，置于錐形瓶中，分別加入12,15,20,25,30,35 g 41%乙醇溶液，與乙醇溶液的質(zhì)量比為13∶100的硫酸銨，在35 ℃下超聲波輔助提取30 min，結(jié)果見圖3。

圖3 地骨皮與乙醇溶液質(zhì)量比對(duì)LCPPs得率的影響

由圖3可知，隨著提取溶劑量的增加，LCPPs得率逐漸提高，當(dāng)?shù)毓瞧し勰┡c乙醇溶液質(zhì)量比為1∶20 時(shí)，即可得到相對(duì)較高的得率；提取溶劑的用量進(jìn)一步增加時(shí)，LCPPs得率無明顯提高。因此,選擇料液質(zhì)量比為1∶20。

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)LCPPs提取效果的影響 稱取1 g地骨皮粉，置于錐形瓶中，分別加入20 g 41%乙醇溶液，與乙醇溶液的質(zhì)量比為13∶100的硫酸銨，在35 ℃下超聲波輔助提取10,20,30,40,50,60 min， 結(jié)果見圖4。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)LCPPs得率的影響

由圖4可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，LCPPs得率不斷提高，在超過50 min后，延長(zhǎng)提取時(shí)間反而導(dǎo)致多酚得率降低?？赡転長(zhǎng)CPPs在過長(zhǎng)的提取時(shí)間下部分結(jié)構(gòu)被超聲波作用破壞，使LCPPs得率降低。因此，選取超聲時(shí)間為50 min進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.1.5 提取溫度對(duì)LCPPs提取效果的影響 稱取1 g地骨皮粉，置于錐形瓶中，分別加入20 g 41%乙醇溶液，與乙醇溶液的質(zhì)量比為13∶100的硫酸銨，在25,35,45,55,65,70 ℃下超聲波輔助提取50 min， 結(jié)果見圖5。

圖5 提取溫度對(duì)LCPPs得率的影響

由圖5可知，隨著溫度升高，分子熱運(yùn)動(dòng)加快，有助于提取物的滲出、溶解、擴(kuò)散，上相顏色不斷加深；當(dāng)溫度為55 ℃時(shí)，LCPPs得率達(dá)到最大；當(dāng)溫度進(jìn)一步升高時(shí)，LCPPs得率開始降低，可能是由于溫度過高時(shí)LCPPs結(jié)構(gòu)被破壞。研究表明，Kukoamine B[2]、綠原酸[22]、阿魏酸等[23]地骨皮中的主要多酚類物質(zhì)在避光和低溫條件下更穩(wěn)定。因此，選擇提取溫度為55 ℃。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化LCPPs提取工藝

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)在41%時(shí)對(duì)LCPPs的提取效率達(dá)到最佳效果；提取溶劑用量在達(dá)到20倍地骨皮粉末質(zhì)量后，繼續(xù)提高溶劑用量對(duì)于提取效率的增加沒有明顯作用。因此正交實(shí)驗(yàn)考察硫酸銨添加量、超聲時(shí)間和提取溫度3因素對(duì)LCPPs得率的影響，因素水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素和水平

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，各因素對(duì)LCPPs得率的影響次序?yàn)榱蛩徜@添加量>超聲時(shí)間>溫度，最優(yōu)組合為A2B2C2，即LCPPs最佳提取工藝為∶地骨皮與41%乙醇溶液質(zhì)量比1∶20，硫酸銨質(zhì)量與乙醇溶液質(zhì)量比為13∶100(g/g)，超聲時(shí)間為50 min，提取溫度為55 ℃， 在此條件下LCPPs平均得率為17.88 mg/g(RSD=1.26%，n=6)。

2.3 LCPPs抗氧化活性研究

2.3.1 LCPPs清除自由基能力 DPPH法、ABTS法和ORAC法評(píng)估LCPPs抗氧化能力結(jié)果見圖6。

由圖6可知，LCPPs和VC對(duì)DPPH·和ABTS·的清除率均隨濃度的提升而增加，LCPPs和VC對(duì)DPPH·的IC50分別為20.00 mg/L和7.19 mg/L； 二者對(duì)ABTS·的IC50分別為59.37 mg/L和68.53 mg/L， 表明LCPPs對(duì)DPPH·的清除能力低于VC，但其對(duì)ABTS·的清除能力高于VC；在檢測(cè)范圍內(nèi)，LCPPs的ORAC值為2.03～2.64 mg Trolox當(dāng)量/mg，即在此范圍內(nèi)LCPPs對(duì)活性氧自由基的清除能力與同條件下2.03～2.64倍濃度的Trolox的清除能力相同。

圖6 LCPPs對(duì)DPPH·，ABTS·的清除率和ORAC值

2.3.2 LCPPs細(xì)胞毒性和對(duì)HSF細(xì)胞內(nèi)總谷胱甘肽含量和SOD的影響 抗氧化防御可以保護(hù)生物系統(tǒng)免受自由基毒性的影響，包括內(nèi)源性和外源性分子。內(nèi)源性抗氧化劑包括酶促途徑和非酶促途徑，SOD是主要的抗氧化酶之一[24]。作為胞內(nèi)最豐富的抗氧化劑，谷胱甘肽可以保護(hù)DNA、蛋白質(zhì)和其它生物分子抵抗氧化損傷[25]。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道VC能夠有效提高損傷HSF細(xì)胞中SOD的含量和谷胱甘肽還原酶的能力[26]，因此以VC為對(duì)照品，考察LCPPs對(duì)受損HSF細(xì)胞內(nèi)總谷胱甘肽含量和SOD活性的影響，結(jié)果見表3。

表3 LCPPs對(duì)HSF細(xì)胞內(nèi)總谷胱甘肽和SOD的影響

實(shí)驗(yàn)中以顯微鏡觀察H2O2處理后的HSF細(xì)胞并檢測(cè)細(xì)胞存活率，結(jié)果表明細(xì)胞形態(tài)和存活率均無明顯變化，但與未損傷細(xì)胞相比，總谷胱甘肽水平從8.82 μmoL/L下降到5.68 μmoL/L，SOD酶活力單位從0.49 units下降到0.29 units；而在不同濃度(低、中、高)的LCPPs和VC的處理后，細(xì)胞內(nèi)總谷胱甘肽含量和SOD酶活力均得到不同程度的提高，LCPPs對(duì)于二者的影響接近于同濃度下的VC。

3 結(jié)論

基于乙醇/硫酸銨雙水相萃取法從地骨皮中提取LCPPs的最優(yōu)提取工藝為∶料液比1∶20，硫酸銨與41%乙醇溶液質(zhì)量比為13∶100，提取溫度為55 ℃， 超聲時(shí)間50 min。LCPPs對(duì)ABTS·清除能力強(qiáng)于VC，對(duì)活性氧清除能力強(qiáng)于Trolox，對(duì)DPPH·清除能力低于VC。細(xì)胞水平抗氧化活性檢測(cè)結(jié)果顯示LCPPs可提高H2O2損傷細(xì)胞內(nèi)總谷胱甘肽含量和SOD酶活力，效果接近于同濃度下的VC。