超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定食品中尼卡巴嗪的殘留標志物

◎ 譚美齡，蔣忠岑

（重慶市萬州食品藥品檢驗所，重慶 404000）

尼卡巴嗪是一種廣譜、高效、穩(wěn)定的抗球蟲飼料藥物添加劑，被廣泛應(yīng)用于雞的養(yǎng)殖[1]。尼卡巴嗪是由4，4’-二硝基均二苯脲（DNC）和2-羥基-4． 6-二甲基嘧啶（HDP）兩類物質(zhì)按1∶1的比例組成的混合物，HDP基本沒有抗球蟲效果，可通過尿液迅速排出體外[2]；DNC是起抗球蟲效果的主要活性成分，在動物體內(nèi)代謝十分緩慢，通常也將其作為尼卡巴嗪的殘留標志物[3]。長期攝入尼卡巴嗪含量超標的食品，會對身體產(chǎn)生危害。

QuEChERS是一種簡單、高效、快速和環(huán)保的樣品前處理方法，可以對不同動物源食品達到最佳的前處理效果[4]。本試驗通過QuEChERS法對樣品進行提取凈化，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 （UPLC-MS/MS）對食品中尼卡巴嗪的殘留量進行分析[5]，為尼卡巴嗪的安全使用、監(jiān)督、檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

4，4’-二 硝 基 均 二 苯 脲（DNC），批 號：C0005423，純度：99.7%，購自北京曼哈格生物科技公司；4，4’-二硝基均二苯脲-D8（DNC-D8），批號：30213203，純度：99.7%，購自德國Witega公司；甲醇、乙腈，均為色譜純，購自德國Merck公司；二甲基甲酰胺、無水硫酸鎂，均為國產(chǎn)分析純，購自重慶川東化工公司；CNW PSA（硅膠鍵合乙二胺基-N-丙基）、CNW LC-C18（硅膠鍵合十八烷基，40～63 μm），購自上海安譜實驗科技股份有限公司。

Dionex UltiMate-3000液相色譜系統(tǒng)-串聯(lián)TSQ Quantum Access Max三重四級桿質(zhì)譜儀（配ESI離子源），購自美國Thermo Fisher Scientific公司；TG20WS離心機，購自長沙湘智離心機儀器有限公司；Reeko AutoEVA-60全自動平行濃縮儀，購自?？萍瘓F股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液配制

稱取DNC標準物質(zhì)0.010 02 g置于10 mL容量瓶中，用二甲基甲酰胺溶解配制成DNC標準儲備溶液（998.994 μg·mL-1）；稱取DNC-D8標準物質(zhì)0.010 00 g置50 mL容量瓶中，用二甲基甲酰胺配制成DNC-D8標準儲備溶液（199.4 μg·mL-1）。分別移取上述溶液，用甲醇稀釋成DNC標準工作溶液（998.994 ng·mL-1）和DNC-D8標準工作溶液（9.97 μg·mL-1）。按照最終定容內(nèi)標濃度為100 ng·mL-1，外標濃度為2 ng·mL-1、 5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、40 ng·mL-1、 60 ng·mL-1、80 ng·mL-1和100 ng·mL-1，采用75%甲醇水溶液進行稀釋配制。

1.2.2 樣品制備

稱取2 g均質(zhì)后的樣品至50 mL離心管內(nèi)，加入4 mL水，渦旋混合1 min。加入100 μL DNC-D8標準工作溶液（9.97 μg·mL-1）和10 mL乙腈，渦旋混合30 s。加入4 g MgSO4及陶瓷子，渦旋混合1 min， 8 000 r·min-1離心10 min。取3 mL上清液，加入400 mg MgSO4、70 mg PSA、20 mg C18，渦旋混合1 min， 8 000 r·min-1離心5 min。取1 mL上清液于氮氣下 （＜40 ℃）吹至近干。將殘余物用75%甲醇水溶液復(fù)溶至1 mL，過0.22 μm微孔濾膜后用于UPLC-MS/MS 測定[6]。

1.2.3 儀器分析條件

色譜柱：XBridge BEH C18，2.1 mm×100 mm， 2.5 μm；流動相：A甲醇、B 5 mmol·L-1乙酸銨水溶液；梯度洗脫：0～1 min，流動相A為20%并保持， 1～2 min，流動相A從20%線性增加至90%，并保持至6 min，6～6.1 min，流動相A從90%線性回至20%，并保持至8 min。；流速：0.20 mL·min-1；進樣量：5 μL；柱溫：40 ℃；離子源：電噴電離ESI（-）；檢測方式：選擇反應(yīng)監(jiān)測掃描（SRM）；電噴霧電壓： -2 500 V；霧化器蒸發(fā)溫度：300 ℃；毛細管溫度：350 ℃；鞘氣（氮氣）：35 psi；輔助氣（氮氣）：10 psi；離子吹掃氣（氮氣）：0 psi；DNC定量離子對：300.991，137.008；DNC定性離子對：300.991，107.097；鏡筒透鏡（Tube Lens）：-24 V；碰撞能量：-22 V（定量）， -40 V（定 性）；DNC-D8定 量 離 子 對：309.156，141.020；鏡筒透鏡（Tube Lens）：-43 V；碰撞能量：-18 V。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的優(yōu)化

大部分動物源性食品的含水量不高（＜80%），根據(jù)樣品特性，向樣品中加入足量的水來為分層萃取創(chuàng)造條件。選用既能提取目標物，又能破除乳化現(xiàn)象，減少脂肪和其他雜質(zhì)的溶出的乙腈作為提取溶劑[4]。適量的無水MgSO4使水溶液飽和，DNC被萃取到乙腈層。本試驗在有機溶劑之后加入的鹽，可以防止樣品局部過熱影響回收率。

在保證目標化合物的提取效率的同時，還要考慮在復(fù)雜樣品基質(zhì)干擾物的去除率。無水MgSO4在凈化過程中將去除多余的水分并提高樣品分布，以免其他吸附劑吸水導(dǎo)致凈化效果不理想。PSA主要是去除樣品中的強極性雜質(zhì)，通過離子交換作用去除樣品中的脂肪酸和氨基酸等負離子。C18是一種硅膠反相吸附劑，因具有較高的碳含量和覆蓋率可以去除樣品中的非極性干擾物，如蛋白質(zhì)、脂類[5]。

2.2 儀器條件的優(yōu)化

DNC結(jié)構(gòu)中含有苯環(huán)，在C18柱上有一定的疏水保留能力，故本試驗選用C18色譜柱對目標物進行分離。使用基線更平穩(wěn)，峰形更好的乙腈作為洗脫流動相。乙酸銨可以提高DNC的電離效率，通過對比 5 mmol·L-1、10 mmol·L-1、15 mmol·L-1和20 mmol·L-1的乙酸銨水溶液，發(fā)現(xiàn)濃度過大，會導(dǎo)致基線水平上移，降低了DNC的信噪比，所以選用5 mmol·L-1乙酸銨的水溶液作為流動相中的水相。采用梯度洗脫的方式，將基質(zhì)的干擾降到最低。

通過質(zhì)譜全掃描方式觀測離子情況，DNC容易丟失H+以形成穩(wěn)定的（M-H）-分子離子，因此本試驗采用負離子掃描對樣品進行分析。從質(zhì)譜調(diào)諧可以看出，在5～60 eV碰撞能量下，由母離子300.991產(chǎn)生的相對豐度比最大的2個子離子的m/z分別為107.097、137.008，選擇響應(yīng)值更高更穩(wěn)定的137.008來定量、107.097來定性，能得到較高靈敏度的質(zhì)譜條件。在MS定量分析時，采用DNC-D8作為內(nèi)標物，以內(nèi)標峰面積與目標物峰面積的比率進行定量分析，用于控制樣品提取凈化、LC進樣、流動相和電離等過程的誤差[7]，提高定量的準確性，加標樣品溶液中DNC及DNC-D8的特征離子色譜圖見圖1。

圖1 加標樣品溶液中DNC及DNC-D8的特征離子色譜圖

2.3 方法學(xué)驗證

根據(jù)《合格評定 化學(xué)分析方法確認和驗證指南》（GB/T 27417—2017）[8]對方法進行驗證，相關(guān)數(shù)據(jù)結(jié)果見圖1和表1。

2.3.1 標準曲線測定

由圖1和表1可知，對加標空白樣品的分析未發(fā)現(xiàn)任何干擾，分析物與標準溶液的相對保留時間偏差在±2.5%，線性度較好。線性相關(guān)系數(shù)R2符合標準所規(guī)定不小于0.99的要求。

2.3.2 基質(zhì)效應(yīng)

由圖1和表1可知，通過計算基質(zhì)效應(yīng)ME值：ME=［（基質(zhì)匹配標準曲線斜率/純?nèi)軇藴是€斜率）-1］×100%，考察樣品基質(zhì)對結(jié)果的影響，結(jié)果在雞肉和雞蛋中表現(xiàn)為弱基質(zhì)增強效應(yīng) （|ME|＜20%）[7]。

2.3.3 精密度和回收率

由圖1和表1可知，回收率符合在濃度水平范圍在 0.1～1 mg·kg-1時，回收率為80%～110%的要求；精密度符合小于11%的要求。對不同樣品下同一添加水平和不同添加水平下同一樣品的檢測情況做顯著性差異分析，檢測結(jié)果均顯示差異顯著（p＜0.05）。

表1 方法學(xué)驗證的相關(guān)檢測結(jié)果表（n=6）

3 結(jié)論

本文建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定食品中尼卡巴嗪殘留量的方法。方法優(yōu)化了前處理及上機過程，提高了準確度和精密度，DNC在濃度10～500 μg·kg-1范圍內(nèi)線性良好，適合大批量的日常分析檢測，為建立同時快速測定獸藥和農(nóng)藥殘留的研究提供了數(shù)據(jù)支持。