米粉中金黃色葡萄球菌定量檢測(cè)盲樣 考核結(jié)果與分析

◎ 譚艷妮，曹明明，李欣蔚，張 健，施 法

（1.沈陽(yáng)食品藥品檢驗(yàn)所，遼寧 沈陽(yáng) 110136；2.沈陽(yáng)沈化院測(cè)試技術(shù)有限公司，遼寧 沈陽(yáng) 110021；3.遼寧省糧食科學(xué)研究所，遼寧 沈陽(yáng) 110032）

金黃色葡萄球菌是引起食源性疾病的重要致病菌，分布較為廣泛，可污染食物、水源等，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的身體健康[1-2]?！妒称钒踩珖?guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中致病菌限量》（GB 29921—2013）[3]中肉制品、水產(chǎn)制品、糧食制品、即食豆類(lèi)制品、即食果蔬制品（包含醬腌菜）、飲料及即食調(diào)味品都對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行了限量要求，可見(jiàn)金黃色葡萄球菌的檢測(cè)在食品安全檢驗(yàn)中具有重要意義[4]。盲樣考核是為了保證各級(jí)食品安全承檢機(jī)構(gòu)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，提高檢驗(yàn)檢測(cè)水平，并以監(jiān)督和考核為目的的測(cè)評(píng)活動(dòng)。2020年10月，沈陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所參加了由中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院組織實(shí)施總局本級(jí)食品安全承檢機(jī)構(gòu)盲樣考核測(cè)評(píng)活動(dòng)，檢驗(yàn)項(xiàng)目為“米粉中金黃色葡萄球菌的定量檢測(cè)”，最終結(jié)果為“滿(mǎn)意”。為提高實(shí)驗(yàn)室工作質(zhì)量，總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，將實(shí)驗(yàn)過(guò)程進(jìn)行回顧分析。

1 材料與方法

1.1 樣品

2個(gè)濃度水平的金黃色葡萄球菌樣品各1瓶，棕色西林瓶包裝，每瓶0.5 g，樣品編號(hào)為MDJP036和MDJP007；避光、-20 ℃儲(chǔ)存；樣品中菌數(shù)的參考范圍：1.0×103～1.0×106CFU·g-1。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

Baird-Parker瓊脂平板，即用型培養(yǎng)基，編號(hào)：024040A，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供；腦-心浸出液肉湯（BHI），編號(hào)：GCM917B，北京陸橋技術(shù)股份有限公司提供；血平板，即用型培養(yǎng)基，編號(hào)：024070，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供；凍干血漿環(huán)，編號(hào)：029180，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供；營(yíng)養(yǎng)瓊脂，編號(hào)：GCM107，北京陸橋技術(shù)股份有限公司提供；磷酸鹽緩沖液（貯存液），編號(hào)：CM1022，北京陸橋技術(shù)股份有限公司提供；革蘭氏染色液；營(yíng)養(yǎng)肉湯，編號(hào)：CM106，北京陸橋技術(shù)股份有限公司提供。。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)菌株

表皮葡萄球菌，編號(hào)：CMCC（B）26069，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌菌種保藏管理中心；金黃色葡萄球菌，編號(hào)：ATCC 6538，購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.4 儀器設(shè)備與耗材

1300 series A2生 物 安 全 柜（Thermo Fisher）、IMH400-S電熱恒溫培養(yǎng)箱（Thermo Scientific）、LBI-250生化培養(yǎng)箱（上海龍躍儀器設(shè)備有限公司）、SX-700 高壓滅菌器（Tomy Autoclave) ）、微量移液器（Sartorius）、 移液器吸頭（Brand）、顯微鏡（Olympus）及一次性接種環(huán)（As One）。

1.5 方法

1.5.1 樣品前處理

將裝有考核樣品MFJP036，MFJP007的西林瓶逐瓶從-20 ℃冰箱中取出，在室溫下放置5 min。在生物安全柜中進(jìn)行無(wú)菌操作，打開(kāi)西林瓶，向每瓶樣品直接加入4.5 mL磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，充分混勻后得到1∶10稀釋度的樣品勻液。吸取1∶10樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注于盛有9 mL磷酸鹽緩沖液的無(wú)菌試管中，振搖試管使其混合均勻，制成1∶100的樣品勻液。按照上述操作，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次無(wú)菌吸頭。

1.5.2 樣品接種

根據(jù)樣品參考范圍1.0×103CFU·g-1到1.0×106CFU·g-1， 選擇10-2～10-8稀釋度的樣品勻液，進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)稀釋度分別吸取樣品勻液0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL接種量分別加入3塊Baird-Parker平板，用無(wú)菌涂布棒涂布整個(gè)平板。

1.5.3 培養(yǎng)

涂布后，將平板正置于培養(yǎng)箱36 ℃培養(yǎng)1 h，待樣品勻液吸收后，翻轉(zhuǎn)平板，倒置培養(yǎng)至48 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 典型菌落計(jì)數(shù)

本次盲樣考核共有樣品2份，每個(gè)樣品進(jìn)行3次平行測(cè)定，每個(gè)稀釋梯度接種3塊Baird-Parker平板，根據(jù)作業(yè)指導(dǎo)書(shū)中給出的菌落范圍進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)Y(jié)果每份樣品均只有10-1、10-2、10-3稀釋度檢出，平板上典型菌落數(shù)見(jiàn)表1。

金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上呈圓形，表面光滑、凸起、濕潤(rùn)，菌落直徑為2～3 mm，顏色呈灰黑色至黑色，有光澤，邊緣淺色，周?chē)@以不透明圈，其外有一清晰帶。當(dāng)用接種針觸及菌落時(shí)具有黃油樣黏稠感[5]。對(duì)于典型菌落必須進(jìn)行革蘭氏染色，血平板劃線以及血漿凝固酶等試驗(yàn)才能最終進(jìn)行判斷，沃氏葡萄球菌和人葡萄球菌在Baird-Parker平板上的菌落特征與金黃色葡萄球菌相當(dāng)接近，肉眼無(wú)法區(qū)分，會(huì)導(dǎo)致最終假陽(yáng)性判斷。

表1 金黃色葡萄球菌定量檢測(cè)平板計(jì)數(shù)結(jié)果表

2.2 染色鏡檢

樣品MDJP036和MDJP007典型菌落革蘭氏染色鏡檢結(jié)果為G+球菌，排列呈葡萄球狀，無(wú)芽胞，無(wú)莢膜，直徑約為0.5～1.0 μm，如圖1所示。

圖1 樣品典型菌落革蘭氏染色鏡檢結(jié)果圖

2.3 血漿凝固酶試驗(yàn)

每只凍干血漿西林瓶加入0.5 mL滅菌生理鹽水至完全溶解，再加入BHI肉湯培養(yǎng)物0.3 mL，充分混勻，蓋好西林瓶塞，置于36 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)，每半小時(shí)觀察一次，觀察6 h，考核樣品MFJP036、MFJP007于培養(yǎng)3 h 后凝固，判定為陽(yáng)性結(jié)果。同時(shí)陽(yáng)性對(duì)照也于培養(yǎng)3 h后凝固，陰性對(duì)照和空白對(duì)照培養(yǎng)6 h后仍未凝固[6]。

3 結(jié)論與討論

本次盲樣考核結(jié)果中的兩份樣品，米粉中金黃色葡萄球菌定量檢測(cè)的Baird-Parker平板計(jì)數(shù)結(jié)果Z值均小于2，為滿(mǎn)意結(jié)果。

本次考核樣品基質(zhì)為米粉，在試驗(yàn)前應(yīng)考慮到基質(zhì)可能會(huì)存在不易溶解的特質(zhì)，因此在稀釋過(guò)程中應(yīng)注意混勻，防止其對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果產(chǎn)生影響；所有即用型Baird-Parker平板培養(yǎng)基在使用前，應(yīng)放在36 ℃培養(yǎng)箱里干燥至表面水珠消失，防止涂布時(shí)因有水珠導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確；本次試驗(yàn)嚴(yán)格按照GB 4789.10—2016中規(guī)定的培養(yǎng)基及試劑進(jìn)行培養(yǎng)和測(cè)定，為確保結(jié)果準(zhǔn)確，今后可加用金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基來(lái)降低干擾菌的影響，防止對(duì)典型菌落的錯(cuò)判和漏判[7]。