PEDV編碼蛋白拮抗宿主天然免疫的研究進展

宋海鑫，丁芳藝，梁 榮，苗晉鋒，盧 宇，劉永杰，張金秋

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫工程研究所，南京210014；2.南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，南京210095；3.省部共建國家重點實驗室培育基地—江蘇省食品質(zhì)量安全重點實驗室，南京210014；4.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州225009；5.江蘇大學藥學院，鎮(zhèn)江212013）

豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）屬于尼多病毒目冠狀病毒科α冠狀病毒屬，是一種具有囊膜的單股正鏈RNA病毒[1]。PEDV感染可引起新生仔豬嚴重嘔吐、腹瀉和脫水，死亡率高達80%～100%。我國自上世紀80年代初首次分離到PEDV后，該病毒就在豬群中持續(xù)存在，并逐漸成為引起仔豬腹瀉的主要病原之一。雖然市售的滅活疫苗及弱毒疫苗具有一定的防控效果，但近年來，豬流行性腹瀉的發(fā)病率仍呈逐年上升趨勢。尤其是2010年以來，隨著PEDV新的變異株的出現(xiàn)，豬流行性腹瀉再次在美洲、歐洲及亞洲的多個國家暴發(fā)，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失[2]。目前，豬流行性腹瀉已成為對我國豬群危害最嚴重的疾病之一。

天然免疫是宿主防御病原微生物感染的第一道防線。病毒入侵后，宿主細胞通過模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）識別病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP），進而促進干擾素及其他促炎細胞因子的產(chǎn)生，使細胞進入抗病毒狀態(tài)；另一方面，病毒在進化過程中會形成多種“精明”的機制，通過編碼相關(guān)蛋白拮抗宿主的防御反應，實現(xiàn)快速增殖，最終導致疾病的發(fā)生。本綜述結(jié)合目前關(guān)于PEDV與宿主細胞相互作用的研究進展，分析了PEDV編碼的各種蛋白在感染過程中對抗宿主天然免疫系統(tǒng)的分子機制，旨在為后續(xù)研究提供思路。

1 PEDV基因結(jié)構(gòu)概述簡介

PEDV基因組全長約為28 kb，含5'端帽子結(jié)構(gòu)和3'端Poly（A）尾巴。從5'端開始，依次為5'非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）、七個開放閱讀框（open reading frame，ORF）ORF1a、ORF1b和ORF2-6）及3'端UTR。PEDV的兩個主要的開放閱讀框ORF1a、ORF1b編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白，且二者之間有46 nt的重疊區(qū)，該重疊區(qū)可發(fā)生核糖體移碼，能夠產(chǎn)生一個ORF1a和ORF1b共同編碼的多聚蛋白1ab（pp1ab）[1,3]。PP1ab是一個多功能蛋白，在內(nèi)部兩個蛋白酶的自切割作用下，可進一步裂解為16個非結(jié)構(gòu)蛋白（nonstructural protein 1～16，nsp1～16），參與病毒的復制及轉(zhuǎn)錄過程。近3'端的ORF編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白：纖突蛋白（spike protein，S）、膜蛋白（membrane，M）、小膜蛋白（envelope，E）、核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，N）和輔助蛋白ORF3。PEDV通過S蛋白與宿主細胞膜上的受體結(jié)合，然后通過膜融合以內(nèi)吞方式進入靶細胞，經(jīng)過脫衣殼作用將病毒的基因組釋放到細胞質(zhì)中，開始病毒復制。

2 冠狀病毒感染激活宿主的天然免疫信號通路

天然免疫信號通路的活化是機體感知病原入侵的重要表現(xiàn)形式，在限制病毒的感染和早期擴散方面發(fā)揮著重要作用。宿主細胞可通過不同的模式識別受體（PRRs）感知病毒的入侵，主要包括Toll樣受體家族（toll-like receptors，TLRs）、視黃醇誘導基因I（human retinoic acid inducible gene I，RIG-I）樣受體家族（RIG-I-like receptors，RLRs）、C型凝集素家族及核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族（NOD-like receptors, NLRs）等[4]。其中與冠狀病毒感染密切相關(guān)的是RLRs和TLRs介導的信號轉(zhuǎn)導途徑。

冠狀病毒感染細胞后，病毒基因組RNA及復制過程中產(chǎn)生的單、雙鏈RNA被胞質(zhì)中的RIG-I/MDA5受體識別，隨后通過線粒體抗病毒信號蛋白（MAVS/IPS-1/VISA/CARDIF）傳遞信號，招募TRAF3/6，進一步激活TBK1/IKK激酶復合體并使其發(fā)生磷酸化，最終激活NF-κ B和IRFs等核轉(zhuǎn)錄因子，進而誘導干擾素（Interferon，IFN）的大量產(chǎn)生。進入內(nèi)體中的病毒RNA還能夠被胞內(nèi)受體TLR3、TLR7或TLR8識別，其中TLR3主要識別雙鏈RNA，TLR7、TLR8主要識別富含G/U的單鏈RNA。TLRs活化后，可招募其下游的接頭蛋白，如MyD88、TRAF3/6等，通過MyD88依賴性或非依賴性通路將信號傳遞給NF-κB和IRFs等核轉(zhuǎn)錄因子，進而誘導促炎癥細胞因子及Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。RLRs及TLRs介導的Ⅰ型IFN產(chǎn)生通路存在共同的信號分子級聯(lián)活化途徑TRAF3-TBK1-IRF3，二者相互聯(lián)系，相互影響。產(chǎn)生的干擾素又可通過自分泌或旁分泌的方式作用于胞外受體IFNAR，激活JAK-STAT通路，誘導大量抗病毒蛋白的產(chǎn)生，如干擾素刺激基因15（interferon-stimulated gene 15，ISG15）、ISG56、核糖核酸酶L（ribonuclease L，RNaseL）、2'-5'寡聚腺苷酸合成酶（2'-5'-OAS）[5]等，可直接降解病毒RNA，干擾病毒RNA的編譯，使細胞進入抗病毒狀態(tài)，如圖1所示。Li等[6]研究表明，小鼠肝炎病毒（Mouse hepatitis virus，MHV）感染少突膠質(zhì)細胞后，RIG-I的表達上調(diào)，且RIG-I和MDA5在該病毒誘導IFN-I產(chǎn)生的過程中是必不可少的。Wang等[7]研究表明，在PEDV感染后12～24 h，抗病毒基因（RIG-I、PKR、OAS1、Mx1和Mx2）和炎性細胞因子（IFN-α、IFN-β、TNF-α、IL-6、IL-8和IL-12）的表達均顯著上調(diào)，提示這些基因可能在PEDV感染后宿主細胞的天然免疫應答中起重要作用。在本實驗室的前期研究中，我們對不同細胞感染PEDV后天然免疫信號通路的變化進行了分析，發(fā)現(xiàn)TLR3、RIG-1、MDA5、TRIF、TRAF3等的mRNA水平在8～24 h內(nèi)均出現(xiàn)顯著升高，表明RLRs及TLRs介導的兩條信號通路中，與RNA病毒識別的相關(guān)受體基因均受到快速激活，進而激活下游的信號傳遞。

圖1 冠狀病毒感染細胞激活RLRs和TLRs信號通路Fig.1 Activation of RLRs and TLRs signaling pathways in coronavirus-infected cells

3 PEDV編碼蛋白在逃避宿主天然免疫中的作用機制

病毒的生長和復制必須在宿主細胞內(nèi)進行，因此病毒入侵細胞后需要創(chuàng)造有利于自身復制和增殖的胞內(nèi)環(huán)境，如調(diào)整細胞因子的活性、調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的信號通路等。目前，PEDV逃避宿主天然免疫的研究已經(jīng)取得實質(zhì)性的進展，病毒或通過隱藏其雙鏈RNA來阻斷RIG-I信號通路的識別，或阻斷抗病毒信號通路中分子信號的傳遞，而病毒復制過程中產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)蛋白及非結(jié)構(gòu)蛋白等與病毒的逃逸機制密切相關(guān)，本文對PEDV編碼的一些重要蛋白在免疫逃避中的作用加以綜述。

3.1 非結(jié)構(gòu)蛋白 PEDV編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白主要參與病毒復制酶復合體的編譯和病毒RNA的合成，其在病毒復制過程中表達，但并不出現(xiàn)在成熟的病毒粒子中。近年來的研究表明，PEDV的多個非結(jié)構(gòu)蛋白能夠抑制宿主天然免疫反應，為入侵的病毒提供了快速復制和擴散的機會。

PEDV編碼的nsp1長度為110個氨基酸，與β冠狀病毒的nsp1同源性較高，且用于維持蛋白結(jié)構(gòu)的重要疏水氨基酸序列具有高度保守性，因此推測其結(jié)構(gòu)和功能上可能具有相似性。研究表明，嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒（Severe acute respiratory syndromes coronavirus，SARS-CoV）和中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle east respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）的nsp1蛋白能夠通過誘導內(nèi)切核酸酶選擇性地剪切宿主mRNA，并能通過結(jié)合核糖體40S亞基阻止宿主mRNA的翻譯。另外，SARS-CoV的nsp1蛋白能夠抑制IFN mRNA的翻譯，進而改變IFN的產(chǎn)生及下游的信號傳遞。與SARSCoV nsp1相似，Zhang等[8]研究證明，PEDV nsp1也是一種有效的IFN拮抗劑，并且在已知的PEDV編碼的多種IFN拮抗蛋白中，nsp1的拮抗活性最顯著。PEDV nsp1能促進蛋白酶體介導的核轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合蛋白（cAMP response element binding protein，CBP）降解，使得IRF3磷酸化入核之后無法和CBP結(jié)合，阻礙增強子復合體的形成，進而抑制Ⅰ型IFN產(chǎn)生。在PEDV感染的IPEC-DQ、LLC-PK1和MARC-145細胞中，nsp1可以通過阻斷IRF1的核移位抑制過氧化物酶體MAVS介導的Ⅲ型IFN的產(chǎn)生[9]。另外，nsp1還可以通過抑制IκBα磷酸化及其隨后的泛素化降解，阻斷p65亞基的核移位，進而抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)運及信號傳導，不僅影響干擾素產(chǎn)生，還影響TNF-α、IL-1β、IL-6等細胞因子的產(chǎn)生[9]。

Nsp3是PEDV編碼的最大的跨膜蛋白，包含兩個木瓜樣蛋白酶結(jié)構(gòu)域（PLP1和PLP2），其中PLP2具有去泛素化酶（deubiquitinating enzymes，DUB）活性，不僅可以識別和處理與K48、K63連接的多泛素鏈，而且還可以去除RIG-I和STING中的泛素結(jié)合物，拮抗IFN-β產(chǎn)生，從而逃避宿主天然免疫[10]。在人類冠狀病毒中也有相似的發(fā)現(xiàn)。SARS-CoV和MERS-CoV編碼的nsp3蛋白對TBK1、IRF3去泛素化，同時與TRAF3、TBK1、IKKε、STING和IRF3互作，抑制IRF3磷酸化以及入核，從而抑制干擾素產(chǎn)生[11-13]。此外，人冠狀病毒NL63的PLP2蛋白可以通過去泛素化并穩(wěn)定MDM2（一種E3泛素連接酶）來增加p53降解，進而抑制p53-IRF7-IFN-β信號通路[14]。

冠狀病毒nsp5是一種具有蛋白水解功能的3C樣蛋白酶（3CLpro），是病毒多聚蛋白加工過程中所必須的，也稱為主蛋白酶。Wang等[15]發(fā)現(xiàn)PEDV的nsp5蛋白能通過靶向切割NEMO（NF-κB essential modulator），阻斷干擾素產(chǎn)生通路。有趣的是，δ冠狀病毒的PDCoV編碼的nsp5蛋白也存在相似功能[16]，另外，屬于冠狀病毒科動脈炎病毒屬的豬繁殖與呼吸綜合征病毒編碼的nsp4蛋白也具有類似的蛋白酶切割活性，推測nsp5的蛋白酶活性及對NEMO的切割現(xiàn)象可能在冠狀病毒科不同病毒間具有高度的保守性和特異性，這為設(shè)計針對不同冠狀病毒的廣譜性藥物或抗病毒抑制劑提供了理論依據(jù)[17]。另外，PDCoV的nsp5還可靶向JAK-STAT途徑，通過裂解STAT2拮抗IFN受體下游的信號傳導[18]。但在PEDV感染的細胞中nsp5是否存在類似的作用機制，仍需要進一步深入研究。

另外，冠狀病毒編碼的其他非結(jié)構(gòu)蛋白，如nsp14、nsp15和nsp16等也被證實具有拮抗宿主天然免疫的功能。在對SARS-CoV或MHV開展的研究中發(fā)現(xiàn)，這些非結(jié)構(gòu)蛋白能夠?qū)Σ《綬NA進行修飾或加工，使病毒mRNA帶有和宿主細胞mRNA相似的甲基化帽結(jié)構(gòu)，從而避免被RLRs受體識別而激活天然免疫信號通路[19-23]。PEDV編碼的上述非結(jié)構(gòu)蛋白與其他冠狀病毒的相關(guān)蛋白同源性較高，因此推測其具有相似的結(jié)構(gòu)和功能，但具體的作用機制尚需進一步的試驗驗證。

3.2 結(jié)構(gòu)蛋白 PEDV S蛋白主要負責病毒吸附和入侵靶細胞，具有良好的免疫原性，對疫苗研究及抗病毒藥物開發(fā)具有重要意義。Yang等[24]最近的研究表明，S蛋白還可與表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）直接相互作用，誘導EGFR活化，并通過JAK2-STAT3負調(diào)控Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，有助于增強和促進PEDV的復制。這與先前在其他病毒研究[25-26]中描述的結(jié)果一致。盡管PEDV S蛋白與EGFR的直接結(jié)合足以觸發(fā)EGFR的激活和Ⅰ型IFN活性的減弱，但仍需要進一步的研究來確定導致EGFR和Ⅰ型IFN信號間干擾的潛在機制。

N蛋白是病毒感染細胞中含量最豐富的一個蛋白，在病毒組裝、細胞周期調(diào)控、細胞凋亡誘導、宿主應激反應等方面發(fā)揮著多功能蛋白的作用[27-28]。N蛋白定位在細胞質(zhì)和細胞核并發(fā)揮作用[29]。Cao等[30]闡明了N蛋白介導NF-κB活化的可能機制，發(fā)現(xiàn)N蛋白通過TLR2、TLR3、TLR9激活NF-κB，這些TLR的siRNA沉默顯著阻斷了PEDV誘導的NF-κB活化。Ding等[31]鑒定出了PEDV N蛋白可以抑制仙臺病毒誘導的IFN-β產(chǎn)生、ISGs表達，以及IRF3和NF-κB的激活，顯著阻礙TBK1或其上游分子RIG-I、MDA5、MAVS和TRAF3刺激的IFN-β啟動子的激活。進一步分析發(fā)現(xiàn)，PEDV N蛋白通過直接阻斷IRF3與TBK1的相互作用拮抗IFN-β的產(chǎn)生。PEDV N蛋白對IFN-β和NF-κB誘導作用的差異，以及其調(diào)節(jié)天然免疫應答的不同分子機制，表明N蛋白可能與多種宿主信號分子相互作用，參與多種宿主信號通路。

3.3 輔助蛋白 ORF3是PEDV中唯一的輔助蛋白。在PEDV感染的細胞中，ORF3主要分布在細胞質(zhì)中，少量分布在高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。用非洲爪蟾卵母細胞作模型，證實ORF3作為離子通道蛋白發(fā)揮作用。通過siRNA使PEDV經(jīng)典毒株CV777 ORF3基因沉默后，Vero細胞培養(yǎng)病毒滴度顯著降低，證明ORF3可以調(diào)控病毒復制，與病毒的感染性和致病性有關(guān)[32]，這與SARS-CoV的ORF3a研究結(jié)果一致[33]。盡管其他冠狀病毒編碼的輔助蛋白，如MERS-CoV的ORF4/5、貓傳染性腹膜炎病毒（Feline infections peritonitis virus，F(xiàn)IPV）的ORF7a等被證明具有調(diào)節(jié)干擾素信號的作用[34-36]，但目前只有一項研究表明PEDV 編碼的ORF3蛋白在體外能抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，因此，PEDV的ORF3蛋白是否具有潛在的干擾素拮抗作用，有待于進一步驗證[8]。另外，在一些適應Vero細胞的毒株中發(fā)現(xiàn)，ORF3基因內(nèi)部截斷或氨基酸序列突變[37-38]，因此，推測ORF3可能與PEDV的細胞適應性及天然免疫的調(diào)節(jié)有緊密聯(lián)系。但由于Vero細胞是干擾素缺陷型細胞，ORF3是否針對宿主天然免疫信號的不同途徑或與其他蛋白協(xié)同作用以阻斷宿主天然免疫應答仍有待驗證。

4 總結(jié)與展望

冠狀病毒是威脅公共衛(wèi)生安全及養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要病原之一。關(guān)于冠狀病毒逃避宿主天然免疫的分子機制已有諸多報道，但主要集中于對SARS-CoV等人冠狀病毒的研究，相比之下，PEDV感染后病毒與宿主的相互作用及病毒逃避免疫監(jiān)視的分子機制仍有待深入研究。近期也有研究表明，PEDV感染的靶細胞—腸絨毛上皮細胞，在病毒感染后能夠選擇性地表達Ⅲ型干擾素，因此其在宿主抗PEDV感染中的作用可能更值得進一步深入研究。

PEDV臨床分離毒株難以在體外進行培養(yǎng)，目前常用的體外培養(yǎng)細胞，如Vero細胞，與PEDV感染的靶細胞—腸絨毛上皮細胞差異較大，因此，如何建立更適宜的體外評價模型，對于深入探究PEDV的復制機制及逃逸機制、尋找新的藥物靶標、開發(fā)新型抗病毒藥物具有重要的理論及現(xiàn)實意義。