禽流感病毒跨種傳播機制的研究進展

汪秀會

（河北工程大學，邯鄲 056000）

AIV（Avian influenza virus，AIV）作為一種重要的人畜共患病病原，嚴重威脅著畜禽養(yǎng)殖業(yè)及人類的公共衛(wèi)生安全。通常情況下，AIV由于對人唾液酸受體的親和性較低而不能直接感染人。但自1997年，香港發(fā)生了首例人感染高致病性H5N1 AIV的事件后[1]，人感染 H9N2、H7N7、H7N3等AIV的事件時有發(fā)生。2013年初，我國華東地區(qū)首次出現(xiàn)了人感染H7N9 AIV的疫情，并迅速在多個省份發(fā)生；同年，陸續(xù)發(fā)生了H6N1（臺灣地區(qū)，僅1例）和H10N8（江西，感染3例，死亡2例）AIV感染人事件；2014年開始出現(xiàn)H5N6 AIV感染人事件（四川、廣東和云南陸續(xù)出現(xiàn)病例）。AIV（1994年，H9N2；1996，H5N1）感染我國禽群的20多年里，給我國的養(yǎng)殖業(yè)造成了巨額損失；連續(xù)不斷的AIV感染人事件的出現(xiàn)，給公共衛(wèi)生帶來了巨大的壓力和挑戰(zhàn)，因此，加強AIV跨種傳播機制的研究迫在眉睫。

1 流感及流感病毒

流感是由流感病毒引起的人或動物的呼吸道疾病，是一種傳染性強、傳播速度快的人獸共患病，多發(fā)于溫度驟變的春秋季節(jié)。流感病毒可通過空氣中的飛沫、人與人之間、人與動物之間、動物與動物之間的接觸或接觸被污染的物品而傳播。流感病毒一般不會引起機體的死亡，多于發(fā)病3～4 d后體溫逐漸恢復(fù)，癥狀好轉(zhuǎn)，但很容易引起并發(fā)癥，造成其他細菌病毒的同時感染，最后因急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）和（或）多臟器衰竭而造成機體死亡。

流感病毒屬于正黏病毒科流感病毒屬的單股負鏈RNA病毒，有囊膜，其上含有致密地鑲成規(guī)則毛邊樣的纖突。初次分離的流感病毒呈桿狀或絲狀，長度可達400 nm。在體外多次傳代后，病毒有球狀、橢圓狀、桿狀、絲狀等多種形態(tài)，直徑一般在80～120 nm。按照不同的分類標準，流感病毒可劃分為不同的類型。按照核蛋白（nuclear protein，NP）和基質(zhì)蛋白（matrix protein，MP）的不同，流感病毒分為A型（甲型）、B型（乙型）和C型（丙型）3種。其中A型流感病毒根據(jù)其表面的血凝素（hemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）的不同，可劃分為16個HA亞型和9個NA亞型。HA和NA之間可以隨機組合，其組合形式可達上百種。其中H1N1、H2N2、H3N2亞型主要感染人，其他亞型流感病毒可感染家禽、豬、牛、犬等。根據(jù)感染宿主范圍的不同，A型流感病毒又可劃分為AIV、豬流感病毒（Swine influenza virus，SIV）、馬流感病毒（Equine influenza virus，EIV）、牛流感病毒（Bovine influenza virus，BIV）、犬流感病毒（Canine influenza virus，CIV）等。其中AIV根據(jù)其致病性的強弱又可分為高致病性禽流感病毒（Highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV）、低致病性禽流感病毒(Low pathogenic avian influenza virus，LPAIV)和無致病性禽流感病毒（None pathogenic avian influenza virus，NPAIV）。B型流感病毒僅感染人，僅引起局部流行；C型流感病毒可感染人和豬，表現(xiàn)為散發(fā)，近年從狗體內(nèi)也分離到了該病毒。2011年已從豬體內(nèi)分離出了該病毒，此后研究者發(fā)現(xiàn)牛是D型流感病毒的主要“病毒儲存庫”[2]。2016年，國際病毒分類委員會執(zhí)委會批準命名了一種新病毒—D型流感病毒，并認為該病毒是流感病毒的一個新屬，與A、B和C型流感病毒存在一定的差異。

流感病毒基因組由8個分節(jié)段的單股負鏈RNA（PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、M、NS）組成，主要編碼PB2、PB1、PB1-F2、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1和NEP共11種蛋白。此外，PB1-N40、PA-X、PA-N155、PA-N182、M42和NS3等蛋白也在近幾年陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，但這些蛋白的功能尚不清楚[3]。流感病毒一般在雞胚尿囊液中進行增殖。組織培養(yǎng)過程中最常用到的是犬腎細胞（madin-darby canine kidney，MDCK）。組織培養(yǎng)過程中可以產(chǎn)生細胞病變（cytopathic effect，CPE）。流感病毒的抵抗力不強，56℃條件下滅活30 min可以使其失活，在室溫下不易保存，但在0～4℃時可以存活數(shù)周左右。

2 禽流感的危害

禽流感是由A型流感病毒引起的一種禽類的急性出血性傳染病，主要以呼吸道疾病和隱性感染為特征。能夠引起禽流感的流感亞型主要有H5N1、H5N2、H5N6、H7N1、H7N7及H9N2等，其中H5和H7可引起高致病性禽流感。

禽流感不僅給養(yǎng)殖業(yè)帶來了難以估計的損失，同時還可以在自然條件下感染多種哺乳動物，包括貓[4]、海豹[5]、狗[6]、高原鼠兔[7]、恒河猴[8]等。隨著候鳥遷徙以及活禽市場的存在，AIV之間以及AIV和季節(jié)性流感病毒之間很容易發(fā)生重組。截止到目前，包括H1N1、H2N2和H3N2在內(nèi)的季節(jié)性流感，已經(jīng)有14種A型流感可以感染人（圖1）。禽流感通常會引起高死亡率，一般介于30%～70%[9]。

圖1 可感染人的亞型流感病毒[9]Fig.1 Human infections with subtypes of Influenza A viruses[9]

3 流感病毒的基因組結(jié)構(gòu)及功能

3.1 非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2的結(jié)構(gòu)及功能 流感病毒基因組片段8編碼NS1和NS2蛋白，包含2個有重疊的開放閱讀框（open reading frame，ORF），即一個大的ORF和一個小的ORF，兩者有部分重疊。NS1（26 kDa）由大的ORF編碼，含有207個氨基酸，不含有內(nèi)含子序列，編碼28-648位核苷酸；NS2是一個含有121個氨基酸殘基、大小為14 kDa的多肽，編碼該段的核苷酸包含內(nèi)含子，因此是由mRNA拼接而成。

NS1和NS2蛋白在感染的細胞內(nèi)大量存在，而不存在于病毒粒子中。其中，NS1蛋白主要在核內(nèi)，NS2則主要在胞漿內(nèi)。A型流感病毒的NS1蛋白可與病毒的RNA結(jié)合，在RNA開始轉(zhuǎn)錄后發(fā)揮獨特的調(diào)節(jié)功能。在缺乏干擾素（interferon，IFN）反應(yīng)的細胞（如Vero細胞）內(nèi)，NS1蛋白的有無對病毒復(fù)制影響并不大。研究表明，NS1蛋白作為輔助因子，對宿主體內(nèi)IFN介導(dǎo)的反應(yīng)具有非常重要的作用[10]。NS1蛋白在復(fù)制過程中具有調(diào)節(jié)作用，在翻譯后產(chǎn)生磷酸化，能與胞質(zhì)中的多聚核糖結(jié)合，然后分布在胞核中。NS2蛋白主要在病毒的繁殖后期大量合成，含有1個核定位信號區(qū)[11]，在病毒組裝過程中對核糖核蛋白（ribonucleo protein，RNP）在胞核和胞漿之間的運輸起一定作用。

3.2 基質(zhì)蛋白M1和M2的結(jié)構(gòu)及功能 流感病毒基因組片段7可編碼基質(zhì)蛋白M1和離子通道蛋白M2，其中M1蛋白（27.8 kDa）含有252個氨基酸殘基，M2蛋白是含有97個氨基酸殘基的多肽，與M1的編碼區(qū)部分重疊，但具有不同的ORF框。M2核苷酸中含有內(nèi)含子序列，故該編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄的mRNA需要經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后的加工修飾等過程。此外，基因組片段7還可能存在第3個編碼區(qū)M3，編碼僅9個氨基酸的多肽。

M1蛋白約占總蛋白質(zhì)的40%，是流感病毒顆粒中含量最為豐富的蛋白，也是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，具有型的特異型。M1蛋白抗原性的差異是流感病毒分型的依據(jù)之一?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)M1蛋白能夠與RNP相互作用，并且在控制轉(zhuǎn)錄、病毒粒子的組裝過程中能與HA、NA和M2蛋白的胞漿尾部相互作用[12]。

M2蛋白由97個氨基酸殘基組成（約15 kDa），N端的前9個氨基酸與M1蛋白相同。M2蛋白插入病毒囊膜形成四聚體離子通道，在病毒脫殼期間將質(zhì)子轉(zhuǎn)入病毒粒子。M2蛋白的離子通道活性與膜內(nèi)pH值有關(guān)，pH值低時M2蛋白被激活，M2蛋白功能的改變或喪失會直接影響病毒的復(fù)制。研究發(fā)現(xiàn)AIV M2蛋白依靠二硫鍵維持一個四聚體形式，從而形成一個質(zhì)子通道，控制高爾基體內(nèi)的pH值。由于M2蛋白形成跨膜離子通道部位的氨基酸序列在人、馬、豬、禽等流感中高度保守，因此M2蛋白是很好的流感疫苗靶標蛋白。

3.3 血凝素（hemagglutinin，HA）的結(jié)構(gòu)及功能HA作為流感病毒主要的表面蛋白，是一種插入到病毒囊膜的Ⅰ型膜蛋白。流感病毒的HA與細胞表面的受體結(jié)合并且誘導(dǎo)膜融合進而開始感染。由于HA的蛋白酶切位點是HA具有感染性的第一步，因此HA的酶切非常重要。在相關(guān)酶的作用下，HA的前體HA0被切割成HA1和HA2，然后激活融合能力[13]。切割位點位于同一個環(huán)上，這個環(huán)突出于HA的表面。由于HA的氨基酸序列和環(huán)的構(gòu)象在不同亞型的流感病毒中存在差異，因此，這些不同也就決定了HA會被不同的蛋白酶進行切割。

HA是A型流感病毒致病性的主要決定因素。HA的切割能力依賴于宿主蛋白酶。其中，高致病性AIV在蛋白酶作用位點具有多個堿性氨基酸裂解位點，而低致病性和哺乳動物流感病毒只具有單個堿性裂解位點。HA蛋白酶敏感性差異和酶的組織專一性的差異是呼吸道感染病毒以及感染的系統(tǒng)性傳播的重要決定因素。人流感病毒和AIV的唾液酸受體具有特異性，其中前者主要結(jié)合α-2,6-唾液酸受體，后者主要結(jié)合α-2,3-唾液酸受體，而目前的研究已經(jīng)表明，在人的組織中也包含AIV的受體。由于季節(jié)性流感和人獸共患的流感病毒所結(jié)合的唾液酸受體的特異性，以及在人的呼吸道中不同受體二代分布情況存在的較大差異，在一定程度上決定了流感癥狀的嚴重程度。

3.4 神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）的結(jié)構(gòu)及功能 NA是流感病毒表面的另外一種很重要的蛋白，是一種Ⅱ型膜蛋白。NA的結(jié)構(gòu)分為頭部和頸部，其主要功能是促進病毒粒子的成熟與釋放，從而促進病毒粒子的傳播和流行。NA還能夠裂解呼吸道黏膜中的唾液酸，使呼吸道黏液的活性減弱，從而有助于病毒顆粒移向靶細胞，促進病毒滲入呼吸道上皮細胞及其在呼吸系統(tǒng)的擴散。

近幾年的研究表明，NA頸部區(qū)域存在很大的不同。通過對GenBank中的N1序列分析發(fā)現(xiàn)，根據(jù)N1頸部區(qū)域的不同可以將其劃分為6種不同的類型[14]。為了驗證NA頸部區(qū)域?qū)α鞲胁《镜纳飳W重要性，研究人員以WSN為骨架，在NA的頸部區(qū)域進行缺失、插入或者突變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NA頸部的長度可以發(fā)生變化，并且其頸部長度與病毒的復(fù)制能力和致病性有關(guān)。

3.5 核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，NP）的結(jié)構(gòu)和功能 核衣殼蛋白由基因片段5編碼，是一種重要的結(jié)構(gòu)蛋白。NP是構(gòu)成病毒核衣殼的重要成分，在病毒的感染周期中具有非常重要的作用。在NP上，共含有三個核定位信號位點（nuclear localization signal，NLS）[15]。NP包含兩個主要的領(lǐng)域：頭部和身體區(qū)域。這兩個域被一個帶負電荷的槽分開，這個槽與RNA結(jié)合有關(guān)。病毒在合成RNA的過程中，NP對病毒從轉(zhuǎn)錄到復(fù)制過程具有非常重要的作用，體內(nèi)和體外病毒感染實驗均證明，如果缺乏可溶性的NP蛋白，病毒則不能從轉(zhuǎn)錄向復(fù)制模式轉(zhuǎn)換[16]。NP蛋白在流感病毒中是一個高度保守的結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒進化的過程中不容易發(fā)生突變。

3.6 聚合酶蛋白的結(jié)構(gòu)和功能 流感病毒的RNA依賴的RNA聚合酶是由PB1、PB2和PA三個亞基組成的三聚體（圖2）。RNA聚合酶復(fù)合體在流感病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中起著舉足輕重的作用。研究表明，PB1通過其N端與PA相連，通過其C端與PB2相連，因此PB1位于聚合酶復(fù)合體的中心位置。PB1、PB2和PA三種蛋白均是在核糖體內(nèi)合成的，合成后，PB2蛋白可單獨入核，而PB1蛋白和PA蛋白則需要形成二聚體后才能夠由細胞質(zhì)進入細胞核內(nèi)[17]。

圖2 A型流感病毒聚合酶的結(jié)構(gòu)和功能區(qū)[17]Fig.2 Structure and functional domains of the influenza A virus polymerase[17]

PA亞基與其他蛋白沒有顯著的相似性，并且PA蛋白功能在很長一段時間都不是很清楚。隨著PA蛋白N末端結(jié)構(gòu)域的揭示，人們才明白，PA蛋白N末端是核酸內(nèi)切酶的活性亞基。通過水解單股RNA和單股DNA，證實結(jié)晶域具有真正的核酸內(nèi)切酶活性。位于構(gòu)成聚合酶三聚體的PA活性位點的結(jié)構(gòu)突變表明，RNA依賴的核酸內(nèi)切酶活性在病毒復(fù)制過程中具有保守性。

PB1亞基，相對于PA和PB2亞基的研究，對PB1結(jié)構(gòu)的研究還不夠具體。聚合酶結(jié)合的中心區(qū)域是基于RNA依賴的聚合酶的保守區(qū)域的特點所預(yù)測的。之前的研究表明，PB1的N端區(qū)域與PA的C端區(qū)域相連，而且這一現(xiàn)象已經(jīng)通過PA的C端的結(jié)構(gòu)被證實。在PB1的另一端，PB1的C端與PB2的N端相連。近期的一項結(jié)晶結(jié)構(gòu)表明，PB1的C端的86個氨基酸與PB2的N端的37個氨基酸是如何緊緊連接在一起的[18]。盡管它的結(jié)構(gòu)很小，但是，在不同的AIV和人流感病毒中他們相互作用的區(qū)域是高度保守的。并且這個區(qū)域還有可能是一個藥物作用靶點。

PB2亞基包含兩個區(qū)域，其中一個區(qū)域是449-495位氨基酸，該區(qū)域的主要功能是使得PB2蛋白能夠進入細胞核，另一個區(qū)域位于PB2蛋白的羧基端，是一個核定位信號，由兩部分組成，位于736-739位氨基酸和752-755位氨基酸[19]。正是由于這兩個區(qū)域的存在，才確定了PB2蛋白在核中的定位。PB2蛋白通過C端的核定位信號，與α-輸入蛋白結(jié)合后進入細胞核。PB2亞基起初被驗證為具有帽子結(jié)合作用的亞基。后經(jīng)過突變確定PB2帽子結(jié)合的作用實際卻是將其與中心殘留物Phe-363和Phe-404隔離開來[20]。這一結(jié)論與之前的研究是不一致的。在該亞基上還可以獲得其他信息，比如核質(zhì)轉(zhuǎn)運。與PA蛋白一致的是，PB2的蛋白序列相似性不高。利用這一特點就可以通過序列比對的方法來確定PB2蛋白上的結(jié)構(gòu)域。但研究發(fā)現(xiàn)，可溶性的PB2不能完整地表達，因此關(guān)于PB2的研究進展緩慢。

4 AIV跨種傳播的影響因素

流感病毒蛋白上發(fā)生適應(yīng)性的點突變是AIV跨種傳播適應(yīng)新宿主的一種重要方式。而大部分的適應(yīng)性點突變出現(xiàn)在負責流感病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的RNP復(fù)合物上。其中，PB2蛋白上存在的一些氨基酸，是影響流感病毒致病性的重要因素，對病毒的復(fù)制、致病性或跨宿主傳播能力等，具有一定的影響，涉及到的位點包括E627K、D701N、A588V、Q591K、S714R、Q591R、M147L、T271A、G590S、E158G等。而且，一些新的適應(yīng)性關(guān)鍵氨基酸位點仍然在不斷被發(fā)現(xiàn)，說明PB2蛋白在流感病毒的基因結(jié)構(gòu)和功能上均起到了舉足輕重的作用。

4.1 PB2蛋白的627K位點 PB2蛋白的627K位點為最常見的哺乳動物適應(yīng)性位點，也是目前流感研究的熱點之一。該位點在H5N1、H7N7、H9N2、H7N9以及H10N8等亞型的流感病毒中均可檢測到，且通常會導(dǎo)致致死性的結(jié)果。Hadjetz等[21]研究表明，含PB2 627K的流感病毒對哺乳動物的適應(yīng)性與宿主的核輸入蛋白importin α1及α7有關(guān)，沉默這兩種蛋白的表達后，流感病毒的聚合酶活力大大降低，importin α7的敲除鼠也表現(xiàn)出了對627K病毒更強的抵抗力。Weber等[22]研究表明，627K適應(yīng)哺乳動物與其對宿主天然免疫相關(guān)的RIG-I蛋白的拮抗有關(guān)。Long等[23]報道了一種新的與PB2 627位點相關(guān)的宿主蛋白ANP32A，哺乳動物細胞內(nèi)ANP32A蛋白的33個氨基酸的缺失限制了627E病毒的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，而這種限制能被627K所克服。Steven等[24]研究表明，存在于哺乳動物的ANP32A不能提高AIV聚合酶活性，而存在于絕大多數(shù)禽類中的ANP32A與哺乳動物的ANP32A在結(jié)構(gòu)上存在顯著差異，該差異對禽源ANP32A克服哺乳動物的宿主限制是必需且足夠的[24]。

4.2 PB2蛋白的701N位點 除了PB2 627K外，PB2蛋白的701N也能增強H5N1、H7N7以及新型H7N9亞型AIV對小鼠的毒力。研究表明，含有701N的H1N1 SIV對哺乳動物的適應(yīng)性具有重要作用。Liu等[25]研究發(fā)現(xiàn)，當H1N1 SIV中發(fā)生D701N突變時，病毒的聚合酶活性、復(fù)制能力，以及在小鼠中的致病性均提高，而病毒復(fù)制能力的提高與宿主細胞importin-α7的調(diào)控有關(guān)。

4.3 PB2蛋白的588V位點 同樣位于PB2 627-domain的588位點，近年來也多有研究報道其與流感病毒哺乳動物的適應(yīng)性相關(guān)。Zhao等[26]研究表明，PB2蛋白T588I的突變能增強甲型H1N1流感病毒在哺乳動物細胞的聚合酶活力、增殖能力，提高病毒對小鼠的致病性。而PB2蛋白的588T位點與147T、339T位點的聯(lián)合作用使得H5N1 AIV對小鼠的致病性增強[27]。PB2蛋白的588V位點在H10N8、H7N9及H9N2等亞型的AIV中與小鼠致病性相關(guān)。這些結(jié)果表明，PB2蛋白的588位點是與病毒哺乳動物適應(yīng)性相關(guān)的重要的位點。在前期研究中，沉默importin-α1、α3、α4、α5及α7五種核輸入蛋白后，檢測HEK293T細胞上聚合酶活力，我們發(fā)現(xiàn)，沉默importin-α1后，PB2 588V聚合酶活力顯著下降，沉默其他蛋白則無下降現(xiàn)象[28]。

4.4 其他影響AIV對哺乳動物適應(yīng)性的因素 其他亞型如 pdmH1N1 PB2蛋白591位的精氨酸（591R）、271 位的丙氨酸（271A）等能夠獨立增強流感病毒對哺乳動物的適應(yīng)性[29]。同時，PB2蛋白與哺乳動物適應(yīng)性相關(guān)的新的氨基酸陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，如H5N1 AIV的S714R、新型H7N9 AIV的K526R等[30-31]。除單個位點的作用外，多個位點聯(lián)合作用導(dǎo)致AIV跨宿主傳播的現(xiàn)象也在不斷顯現(xiàn)，并且當這些位點伴隨著627K同時存在時，其對哺乳動物的致病能力大大提高[32]。以上研究表明，AIV適應(yīng)哺乳動物宿主可能有更多新的突變形式存在。

除了PB2蛋白上的這些適應(yīng)性標志外，隨著流感疫苗的不斷使用，流感病毒對宿主細胞的親和性由α-2,3-唾液酸受體逐漸具有了與α-2,6-唾液酸受體結(jié)合的能力，這為流感病毒跨宿主傳播奠定了基礎(chǔ)。另外在PB1、PA、NP和NEP蛋白上的一些突變也對哺乳動物的復(fù)制和致病性具有提高作用[33-34]。

5 小結(jié)

AIV在我國禽群中的流行已經(jīng)超過20年，并多次感染人。AIV跨越種間屏障感染哺乳動物與流感病毒基因組的結(jié)構(gòu)特點密不可分，PB2蛋白是跨宿主傳播最重要的因素之一。AIV給我國的養(yǎng)殖業(yè)造成了巨額損失，連續(xù)不斷的AIV感染人事件的出現(xiàn)，給公共衛(wèi)生帶來了巨大的壓力和挑戰(zhàn)，因此，加強AIV跨種傳播機制的研究顯得尤為重要。