山羊鼻內(nèi)腫瘤病毒熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

肖霜艷，翟少倫，陳小文，謝逸倫，周秀蓉，呂殿紅，溫肖會(huì)，翟 頎，賈春玲，魏文康，劉正飛

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，武漢430000；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所 廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，廣州 510640；3.四會(huì)市畜牧獸醫(yī)局，四會(huì)526200）

羊鼻內(nèi)腫瘤病毒（Enzootic nasal tumor virus，ENTV）屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科β反轉(zhuǎn)錄病毒屬，主要有山羊鼻內(nèi)腫瘤病毒（Enzootic nasal tumor virus-2，ENTV-2）和綿羊鼻內(nèi)腫瘤病毒（Enzootic nasal tumor virus-1，ENTV-1）兩種類型，分別以山羊和綿羊?yàn)橐赘兴拗鱗1]。1995年，在內(nèi)蒙古首次發(fā)現(xiàn)我國(guó)的羊鼻內(nèi)腫瘤（enzootic nasal tumor，ENT）病例[2]。

隨著對(duì)ENT的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，該病四季可發(fā)，存在地域性差異，可水平傳播[3]。傳染源主要是患病羊、帶毒羊以及被污染的牧草等，可通過(guò)直接接觸感染其他羊群。ENTV-2的檢出率在0.5%～15%[4]，致死率高達(dá)100%。目前，ENTV-2在我國(guó)內(nèi)蒙古、湖南、四川、陜西、廣東和重慶等地相繼被檢測(cè)出來(lái)，流行范圍呈現(xiàn)擴(kuò)大的趨勢(shì)[2-3,5-7]。ENTV-2與ENTV-1、綿羊肺腺瘤病毒（Jaagsiekte sheep retrovirus，JSRV）以及內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒（Endogenous retrovirus，ERVs）在基因序列上有較高的同源性，可高達(dá)88%以上[8]。ENTV-2多分布在血液、拭子、組織等樣品中，在血清中的拷貝數(shù)較低，這給ENTV-2的檢測(cè)和鑒別帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法特異性高、檢測(cè)限低，適合應(yīng)用于ENTV-2在血清中的檢測(cè)[9-10]。本研究針對(duì)env基因設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立了檢測(cè)ENTV-2的熒光RT-qPCR方法。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒、對(duì)照品及試劑 山羊鼻內(nèi)腫瘤病毒陽(yáng)性重組質(zhì)粒由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所制備保存；病毒基因組提取試劑盒購(gòu)自AXYGEN公司；一步法RT-PCR擴(kuò)增試劑、膠回收試劑盒、E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞、DL600 DNA marker購(gòu)自TaKaRa公司；pGM-T載體、高純度小提中量試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司；山羊痘活疫苗購(gòu)自重慶澳龍生物制品有限公司；山羊痘與小反芻獸疫二聯(lián)苗購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)揚(yáng)州威克生物工程有限公司；羊敗血性鏈球菌病活疫苗購(gòu)自青海生物藥品廠有限公司；牛病毒性腹瀉病毒毒株、邊界病毒毒株、羊副流感病毒3型毒株由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所毛立博士饋贈(zèng)。

1.2 樣品來(lái)源及處理 結(jié)合臨床診斷與分子生物學(xué)診斷確診為ENTV-2陽(yáng)性的樣品來(lái)源于廣東省陽(yáng)西縣某山羊場(chǎng)，將采集鼻拭子置于裝有2 mL、4℃預(yù)冷PBS的EP管中；反復(fù)凍融3次，取上清液后保存于-80℃，使用病毒基因組提取試劑盒提取病毒核酸。

1.3 引物探針設(shè)計(jì) 參考羊鼻內(nèi)腫瘤病毒CQ1株（MK164400）、ENTV/CH/GT/2015株（MK210250）、GDQY2017株（MK164396）、E N T V 2-S C株（H M 1 0 4 1 7 4）、S h a n x i株（KU179192）、ENTV2株（AY197548）、enJSRV2-19株（EF680304）、ENTV-1NA1株（GU292317）、ENTV-1OVC株（KC189895）、JSRV株（M80216）和JSRV21株（AF105220）的全基因組序列，針對(duì)env基因設(shè)計(jì)特異性好、保守性高的引物和探針，預(yù)擴(kuò)增片段大小為124 bp。由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其序列如下：ENTV2-F：5'-ATGGCAATAGTTTATATCTG CAAT-3'；ENTV2-R：5'-GATGGCCTTGTATCAA CATAAATGG-3'；ENTV2-Probe（探針）：5'-FAM-ATATAAGAATCCCGTAACACCTACATCTC-BHQ1-3'。

1.4 目的基因的擴(kuò)增 將上述陽(yáng)性樣品提取核酸，使用一步法RT-PCR試劑盒（TaKaRa）及引物ENTV2-F/R擴(kuò)增目的片段。反應(yīng)體系（25 μL）：PrimeScriptTMOne Step Enzyme Mix 0.5 μL，2×One Step Buffer（Dye Plus）12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，RNase Free ddH2O 8 μL以及模板3 μL。反應(yīng)程序：50℃ 30 min；95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，53℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5 min。2.0%瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物并純化回收。

1.5 克隆及驗(yàn)證 將純化目的片段與pGM-T載體連接，反應(yīng)體系（10 μL）為：pGM-T 載體 1 μL、目的片段5 μL、T4 DNA Ligase 1 μL、10×T4 DNA Ligation Buffer 1 μL、ddH2O 2 μL；16℃連接過(guò)夜后，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含IPTG和X-gal的氨芐平板上，37℃恒溫培養(yǎng)12～16 h，挑取單個(gè)白色菌落接種于含氨芐的液體LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h后，提取重組質(zhì)粒pE-Ta送生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序，比對(duì)測(cè)序結(jié)果。

1.6 一步法熒光RT-PCR檢測(cè)方法的建立

1.6.1 退火溫度優(yōu)化 以陽(yáng)性重組質(zhì)粒pE-Ta為模板，反應(yīng)體系（25 μL）：PrimeScriptTM1 Step Enzyme Mix 0.5 μL，2×1 Step Buffer（Dye Plus）12.5 μL，上、下游引物與探針（10 μmol/L）各1 μL，RNase Free ddH2O 6 μL，模板2 μL。反應(yīng)程序：50℃ 30 min；94℃ 2 min；98℃ 10 s，50℃～60℃30 s，45個(gè)循環(huán)，在退火過(guò)程中采集熒光信號(hào)。退火溫度在50℃～60℃范圍設(shè)置8個(gè)溫度梯度，上述試驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.6.2 引物及探針濃度優(yōu)化 將引物及探針稀釋至10 μmol/L，分別以0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、2 μL陽(yáng)性重組質(zhì)粒pE-Ta為模板，加入1 μL（10 μmol/L）探針。按照上述體系及程序進(jìn)行擴(kuò)增。選擇合適的引物濃度，加入探針（10 μmol/L）的量分別為：0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、2 μL。其余試劑和反應(yīng)程序同上，上述試驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.6.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 選取陽(yáng)性重組質(zhì)粒pE-Ta為模板，進(jìn)行10倍倍比稀釋（5.61×101～5.61×109copies/μL，9個(gè)梯度），用優(yōu)化好的反應(yīng)體系和程序進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，并設(shè)置空白對(duì)照。根據(jù)起始模板濃度對(duì)數(shù)與反應(yīng)的循環(huán)數(shù)（Ct值）的線性關(guān)系，建立一步法熒光RT-PCR檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.4 判定標(biāo)準(zhǔn) 以最低檢測(cè)限濃度的質(zhì)粒為模板，用所建立的一步法熒光RT-qPCR檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，設(shè)置15個(gè)重復(fù)，對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)合靈敏度檢測(cè)進(jìn)行判定標(biāo)準(zhǔn)確定。

1.6.5 特異性試驗(yàn) 分別提取羊副流感病毒3型病毒、小反芻獸疫病毒與山羊痘病毒二聯(lián)弱毒苗、山羊痘病毒弱毒苗、羊邊界病毒血清與牛病毒性腹瀉病毒液的相應(yīng)病毒核酸作為對(duì)照組模板，以ENTV-2陽(yáng)性血清中的ENTV-2核酸為陽(yáng)性對(duì)照，參考方法確定的ENTV-2陰性的無(wú)癥狀肺組織為陰性對(duì)照，用所建立的一步法熒光RT-qPCR檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照。

1.6.6 敏感性試驗(yàn) 以山羊鼻內(nèi)腫瘤病毒陽(yáng)性重組質(zhì)粒pE-Ta為模板，進(jìn)行10倍倍比稀釋（5.61×100～5.61×109copies/μL），用所建立的一步熒光RTPCR檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，測(cè)定該方法的敏感性。

1.6.7 重復(fù)性試驗(yàn) 對(duì)不同濃度的陽(yáng)性質(zhì)粒（5.61×106、5.61×104、5.61×102copies/μL）分別進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)。批內(nèi)試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)樣本重復(fù)，批間試驗(yàn)分3次進(jìn)行。對(duì)Ct值的平均值（）、標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）和變異系數(shù)（CV）進(jìn)行分析。

1.7 建立的一步法熒光RT-qPCR檢測(cè)方法的臨床應(yīng)用 收集廣東省內(nèi)的山羊血清樣品100份，其中疑似ENTV-2感染的樣品8份，無(wú)臨床表征的樣品92份。提取核酸，采用本研究建立的一步熒光RT-PCR方法進(jìn)行ENTV-2的檢測(cè)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果

2.1 目的基因擴(kuò)增及驗(yàn)證 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳中可見(jiàn)1條約124 bp的條帶，大小與預(yù)期片段相符（圖1），并且測(cè)序結(jié)果與目的序列一致。

圖1 ENTV-2目的基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of ENTV-2 target gene

2.2 退火溫度及引物探針濃度優(yōu)化 通過(guò)對(duì)退火溫度和引物探針濃度優(yōu)化，在Tm 53℃時(shí)，Ct值最小，且擴(kuò)增效率最高；引物和探針的終濃度分別為0.5、0.6 μmol/L時(shí)，所對(duì)應(yīng)的Ct值最小，且絕對(duì)熒光信號(hào)強(qiáng)度最高。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 該方法的擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線如圖3A所示。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)，由系統(tǒng)計(jì)算得到相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3B），標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y= -3.26x+14.23，R2=0.999，E=102%。結(jié)果表明，Ct值與標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)線性關(guān)系較好。

圖2 一步法熒光RT-qPCR的擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 One step fluorescence RT-PCR amplification kinetics curve and standard curve

2.4 結(jié)果判定 Ct值≤40，且出現(xiàn)明顯的S型擴(kuò)增曲線，判定為陽(yáng)性；無(wú)Ct值，且無(wú)擴(kuò)增曲線判定為陰性；40＜Ct值≤42，有擴(kuò)增曲線，判定為可疑，重復(fù)試驗(yàn)后，有Ct值和擴(kuò)增曲線判定為陽(yáng)性。

2.5 特異性試驗(yàn) 山羊鼻內(nèi)腫瘤病毒陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)S曲線并有Ct值（24.27），曲線①；山羊痘病毒、小反芻獸疫病毒、牛病毒性腹瀉病毒、邊界病毒、羊副流感病毒三型、陰性對(duì)照與空白對(duì)照均未呈現(xiàn)明顯的S曲線且無(wú)Ct值，曲線②。表明本研究建立的針對(duì)ENTV-2一步法RT-qPCR檢測(cè)方法具有良好的特異性，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Specificity test results

2.6 敏感性試驗(yàn) 結(jié)果顯示，本研究建立的針對(duì)ENTV-2的一步法熒光RT-qPCR檢測(cè)方法的最低檢測(cè)限為5.61 copies/μL，表明該方法的靈敏度高，最右側(cè)藍(lán)紫色擴(kuò)增曲線對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒濃度為5.61 copies/μL（圖4）。

圖4 敏感性試驗(yàn)擴(kuò)增曲線Fig.4 Sensitivity test amplification curve

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 根據(jù)批內(nèi)試驗(yàn)獲得的Ct值計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、變異系數(shù)，并分析數(shù)據(jù)，可知該方法批內(nèi)重復(fù)性較好，CV均小于1.0%（CV≤5%，試驗(yàn)數(shù)據(jù)有效），該方法重復(fù)性較好。根據(jù)批內(nèi)試驗(yàn)獲得的Ct值計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、變異系數(shù)，并分析數(shù)據(jù)，可知該方法批間重復(fù)性較好，CV均小于1.5%（CV≤5%，試驗(yàn)數(shù)據(jù)有效），結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 批內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Intra-batch test results

表2 批間試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Inter-batch test results

2.8 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果 收集廣東省內(nèi)的山羊血清樣品100份，其中疑似ENTV-2感染的樣品8份，無(wú)臨床表征的樣品92份。采用本研究建立一步熒光RT-qPCR對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，共檢查出ENTV-2陽(yáng)性樣品10份，該檢測(cè)結(jié)果與Apostolidi等[11]建立的方法檢測(cè)結(jié)果一致，陽(yáng)性樣品檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。ENTV-2的陽(yáng)性部分樣品擴(kuò)增曲線如圖5所示，陽(yáng)性對(duì)照Ct值為25.67，陽(yáng)性樣品Ct值為29.35，陰性對(duì)照無(wú)Ct值。

表3 臨床比對(duì)試驗(yàn)Table 3 Clinical comparison test

圖5 臨床樣品檢測(cè)擴(kuò)增曲線Fig.5 Clinical sample detection amplification curve

3 討論

ENT的防控主要存在以下幾個(gè)問(wèn)題：在預(yù)防方面，由于ENTV-2能夠?qū)C(jī)體產(chǎn)生免疫抑制作用，目前還沒(méi)有研究出相應(yīng)的疫苗；在治療方面，市場(chǎng)上未發(fā)現(xiàn)針對(duì)ENT治療的特效藥，采取手術(shù)治療的方式，發(fā)現(xiàn)該方法在難度、實(shí)用性及預(yù)后的評(píng)價(jià)等方面均較低[12]；在診斷方面，ENT的潛伏期與病程長(zhǎng)短不一，表現(xiàn)出癥狀的羊只年齡為3個(gè)月～5歲齡[3]，且其臨床癥狀與感冒初期癥狀相似，在臨床診斷上易與感冒混淆。目前，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)建立的ENTV-2熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法主要有兩種：第一種是基于TaqMan探針?lè)ń⒌膶?shí)時(shí)熒光TaqMan法，引物及探針設(shè)計(jì)是基于希臘7株已知的ENTV-2毒株基因組設(shè)計(jì)的，反應(yīng)程序最低耗時(shí)為2.25 h，檢測(cè)限為2×102RNA轉(zhuǎn)錄本[10]；第二種是基于Eva Green新型染料建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)限為30個(gè)拷貝數(shù)，該方法使用的染料為新型染料，相對(duì)于SYBR Green染料其特異性高，成本低，但特異性與實(shí)時(shí)熒光TaqMan法相比較低[13]。本研究建立的一步法熒光RT-qPCR檢測(cè)方法的引物與探針設(shè)計(jì)基于已知的來(lái)源于不同地區(qū)不同時(shí)期的ENTV-2毒株全基因組，與前兩種方法比較，其檢測(cè)限低（5.61 copies/μL），特異性高，重復(fù)性好，變異系數(shù)均低于2%（0.09%～1.11%），耗時(shí)短，效率高，檢測(cè)的范圍大，對(duì)檢測(cè)樣品的核酸純化要求低等優(yōu)勢(shì)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，可以在已知待檢樣品Ct值的情況下，推算出待檢樣品的初始濃度，因此，該方法不僅可以進(jìn)行定性檢測(cè)還可以進(jìn)行定量檢測(cè)。

ENTV-2在廣東省的檢出率為10%（CI為4.9%～17.6%），有明顯呼吸道癥狀的檢出率為100%（CI 63.1%～100%），比無(wú)癥狀的檢出率高出2.17%（CI 0.3%～7.6%）。當(dāng)表現(xiàn)出典型的臨床癥狀時(shí)，ENTV-2的檢出率高。ENTV-2屬于慢性傳染性疾病，且較難診斷，所以在同一羊群中的流行率偏高，影響其流行率的因素還有養(yǎng)殖環(huán)境、方式和密度等。

總之，本研究建立的一步法熒光RT-qPCR檢測(cè)方法為ENTV2的檢測(cè)以及流行病學(xué)調(diào)查提供了可靠的技術(shù)支撐。